细胞中蛋白质提取

zxcv12345

回复 冰枫de梦 的帖子
! W9 G1 e" i2 D% @" f
& b: q' _8 }+ o5 r" A0 u  J, vTrizol法是可以提取RNA、DNA和蛋白的。详细方法见Sigma的说明书。提出的蛋白由于变性，不能做IP，但是还是可以做westernblot，这是没问题的。有点麻烦是，沉淀的蛋白不容易溶解，需要有点耐心。提取的DNA有人说PCR效果不好，我没用过

冰枫de梦

回复 LQAI2012 的帖子
! ~; e/ b( t+ t0 p# d1 }" |
# l: u4 v, y, F- t& f* t4 j' _谢谢了，那么蛋白怎么沉淀呢

LQAI2012

回复 冰枫de梦 的帖子" I- W! t6 e6 b/ N+ ^" ~
2 ], T- k, S; n# M6 }% C' J# `
沉淀完DNA的中层和下层液体，里面存在着需要的蛋白。: @* @* u  O9 Y) U
沉淀DNA后的上清，用异丙醇好像是可以沉淀下其中的蛋白的。但具体的用量和比例我也不太清楚，不过其它地方应该是可以查到的。
' N# ]5 z# l" N# P5 C% A其实，这种方法理论上是可行的。但大家认为它还存在着很多缺点，如，好像有人说这样得到的蛋白不太容易溶解

mayansen1314

回复 冰枫de梦 的帖子$ e/ J/ s6 Y# K- `* c$ F( u

' K7 n6 {, p3 e. c* `我们实验室一直用的是凯基全蛋白提取试剂盒，按照他上边的说明书操作。
* f) P- [: V) V不过最经我的蛋白样提的不是很好，还不确定是什么原因
4 |1 w9 {; V; X) W* v( Y7 _  F我想应该是我淹没环境温度没控制好

sj03572001

加入了氯仿分层后，蛋白质存在于底层的黄色有机相中，可以通过异丙醇进行沉淀，具体方法：将有机相吸出，加入200ul 无水乙醇混匀，室温静置5min， 4度，5500rpm ，离心10分钟，取上清至新离心管中，加入1ml 异丙醇, 充分混匀，室温静置10mim， 4度，13000rpm ，离心10分钟，弃上清，用1ml 含有0.3M盐酸胍的95%乙醇进行洗涤蛋白沉淀，室温静置20min，4度，13000rpm ，离心10分钟，弃上清，洗3次，最后再用无水乙醇洗一次，蛋白沉淀可用1%SDS进行溶解。

bioaizhiying

Amnion（life teconologies）公司 的trizol是可以同时提取蛋白质，RNA，DNA的，楼主可以下载说明书看看，上面有详细的步骤，而且需用到什么试剂说明书上都写着呢。

trl137

1 理论上说，利用trizo可以分别提取DNA，RNA和蛋白质，因为加了三氯甲烷后，就产生分层，这三种物质分别存在，可吸出用不同的溶剂沉淀；
- O4 e) S8 `  C  q- ^2 但是，事实上，这样难度很大，RNA在最上层无色水相，下面的不一定是DNA和蛋白质，因为细胞裂解后，还会有胞外的一些物质，还有多糖类，所以不实际，会有杂质
# d7 @2 D1 V( h* V4 U$ ?3 提取细胞蛋白质有专门的细胞蛋白提取试剂盒

redmaple

提细胞蛋白这样的protocol，到处都有，可以到网上下载。

redmaple

tris-hcl 50mM, EDTA 1mM, 1% NP40, 10% 甘油， 加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。sigma cocktails。

aptx48

其实是非常简单的，invitrogen的trizol的manual里就有所有提RNA/DNA/protein的详细步骤，但是除了DNA提取还算方便，感觉回收trizol里的蛋白是比较麻烦的，花的时间较长，而且提出的蛋白是基本是变性的。# ~6 b& t8 Q4 R2 l' B6 M* Z
细胞内蛋白的提取方法非常多，依后续实验的不同而不同，最好先告诉大家你要做什么实验。