请教一个CHIP的问题 超声之后解交联的DNA能否用来扩增目的基因

深海鱼

如题，因为超声随机性，不能保证要扩增的目的基因片段仍保持完整，所以将超声后产物解交联，得到的DNA能否用于目的基因扩增？若扩不出来，是不是说明超声将目的基因打碎了就不用继续做了，因为做完那个片段仍是碎的 检测不出。. s, _2 x9 D9 Q7 H9 a, B
请大侠指教，欢迎讨论~

深海鱼

自顶一个！3 s3 C3 ^1 w; l6 V: a, `9 q
令大家都用什么盒子做CHIP，快用完了打算再买一个

不倒翁

不是这样的 你需要好好看一下CHIP的原理 DNA是随机打断的  但是你扩增的时候只扩增基因的某些部分 和real time 一样 只检测一部分 所以设计扩增引物的时候要看看有没有预测的结合位点 没有的话要尽量涵盖大部分片段

cronos0910

超声后产物解交联，得到的DNA可以进行PCR
3 a7 y, Y9 G$ A8 i$ H8 s2 C  P7 r# d0 [. G9 r5 p
超声后产物建议你先做电泳来确定超声效率: m. K+ M2 Z$ l9 {  G6 }
9 U% O2 l3 H, Y0 b6 A/ n
你的的ChIP做不出来有几种可能的的问题  i8 y, v1 J6 ^) [/ _
% h4 v6 K( k- d5 m! Y' g
第一个可能是因为你的目的基因并没有预期的结果0 ?7 e6 z* ~/ f7 ?$ P
& o( P# w% g2 t6 D4 B2 m
第二个可能是你所用的细胞数不足% O. p5 _  p* f. R9 A$ y; V! l" D

, n% P, A& W  M第三个试试看重新设计引子
) M& C% w$ Y! A+ q$ M, k: N. m9 \8 X
我用的盒子Millipore的Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit

cneagle66

对于长片段应该会有影响吧。如果长片段被打断了，拷贝数不一样的标本，会不会受影响？

embryonic12

回复 cronos0910 的帖子8 g, ]  q  Y; \/ k' m" Q

  Z( ~+ o8 G5 m" f您好!6 z* W; B: A6 c* m2 ]
请教一下，如何通过超声后产物电泳来判断超声效率呢？
; S0 A$ B9 n" _" ?: D+ k* l% R5 P另外，最后一步PCR时用realtime 和普通的PCR区别大么？看到有人发帖说：“返回的审稿意见要求将普通PCR换为realtime”。但差了一些最近发的文章，不少还是普通PCR呀？
8 Y) C3 e6 D$ _. P+ ~& V5 r谢谢指点！

cronos0910

你好8 j3 q; I" E" l. Z
1 {# i% v( N, L, L
的ChIP的超声产物片段大小最好在300-500bp的间
7 v! r8 o3 M3 H9 K: m（普通PCR扩增引子工程学系放大的片段最好简在100-300bp的，实时PCR的则为100-200bp）" O- k3 Z$ N: I. |. N% P  X
跑电泳时可看片段是否在那段范围间6 d. g5 i" D8 f- v& g: x: H
不同的样本要自己测试超声的条件
' Z( \" S& }1 m" F: m! K
( ~2 j% }' v4 L4 u( Q& S最后一步建议使用实时聚合酶链反应
# \  B/ \7 G# e. V8 h: d% L1 b因为可以做近一步的定量
# _+ A3 [/ k/ b2 i这样的ChIP的结果才比较给力4 Q1 w# O, T* y
普通PCR技术还会有定量的问题. Q$ ?; ]7 }3 F' N' P( `
如果想要发在好的杂志建议使用实时聚合酶链反应

cronos0910

3 p3 Z, C( X/ j& b  k1 C你好6 Z3 W' {: r8 X+ H. _( I
3 C/ ~6 `" E0 ?9 G
的ChIP的超声产物片段大小最好在300-500bp的间  I' G$ ~+ E, p( @6 V
（普通PCR引子放大的片段最好简在100-300bp的，实时PCR的则为100-200bp）. N/ x, N. C( I0 z: Q
跑电泳时可看片段是否在那段范围间
& j. _6 [3 B' A* x) ~$ z/ g4 {不同的样本要自己测试超声的条件+ R5 E  f# P: ~. _

# B) L7 |" W- S# n/ k7 [. i/ M最后一步建议使用实时聚合酶链反应* n0 q( R5 |% q+ U+ q
因为可以做近一步的定量
' y/ Q/ F1 F! h; r3 ~$ p6 {- `这样的ChIP的结果才比较给力8 A3 g$ a  }) x( ?& {. j& P8 I
普通PCR技术还会有定量的问题! D2 d8 h. t3 @+ m7 t8 u; n
如果想要发在好的杂志建议使用实时聚合酶链反应

ndwzf

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% N. U6 a. Z% u* [
; W4 i, s1 n9 a. G您好！非常感谢您的指点。
! I/ I. _0 p) k) N% R. N& C" [如果用实时PCR检测，那就要先做标准曲线，我的疑问是用什么样的模板来做标准曲线呢？

cronos0910

用超声后，免疫沉淀前的基因: ?' A# w) {6 o7 X( o# C4 `
然后用同样的引子做标准曲线