Western Blotting

新疆八钢

各位同道，最近在做Western Blotting，在电泳过程中，连续两天出现蛋白样本在浓缩胶中没有被压缩，就开始电泳，导致蛋白条带扩散影响下一步结果的现象。所用的试剂加的正确，过程也完全按正规程序加的，这种情况以前未遇到过，有谁知道为什么？是不是天气太冷，导致胶凝固慢所致。现在广州温度15摄氏度左右

bioaizhiying

我一般配5%浓缩胶，1.5cm长，足够浓缩样品了。若有问题说明是试剂出现了问题。APS容易失效，不要反复冻融。

mirrida

肯定不是温度低的原因，我们冬天都还做WB。是不是上层胶的密度太大了，大小分子蛋白已经被分开，或者是下层胶漏，导致上层胶太宽，还有就是可能不是上层的原因，下层胶凝之前没混匀也会出现带扩散。WB一次没做出来很正常。

zhanglei1414

1，浓缩胶太长，2，浓缩胶浓度大大，3，跑浓缩胶的电压太小

LQAI2012

建议可以检查一下，用于浓缩胶配制的Tris hcl的PH值是否还在6.8附近，蛋白在浓缩胶中的压缩与这个PH关系很大
; R' P2 a2 p9 H0 O3 _然后，跑浓缩胶的的电压和时间是否合适？" z8 s  Q: _8 U- j  p6 H5 S" f
再有，是否在合适的时候，将电压改为分离胶的电压？

mansnoopy

回复 新疆八钢 的帖子9 K5 S& J3 B/ X. @: {

( }& |( T. m4 }% a0 |  @) L还是浓缩胶的问题，跟温度等没有关系。仔细看看浓缩胶用到的试剂是否有问题，最好全部重新换掉！！

sallyshaomy

我觉得是你的loading buffer有问题，蛋白没有被完全沉淀

holywater

缓冲液PH不对，蛋白上样浓度太高，蛋白盐离子浓度不对

新疆八钢

回复 LQAI2012 的帖子# [$ z2 ~  X9 J/ o1 B6 q9 H

, C. z! E) G- m9 y! g& }2 |. Z谢谢各位同道：
/ G* M& u- n4 s7 n3 A是Tris Hcl的问题，放置太久，PH值发生变化，已经纠正。
- X) q( _6 Z3 A6 h# }4 G& {3 }建议各位同道在配置Tris Hcl的时候，配置合适的体积，长时间放置容易PH值改变。

LQAI2012

回复 新疆八钢 的帖子7 W9 [( e$ h+ W
' ^/ S3 D* y7 x3 f% s4 G, Q
嘿嘿   问题找到了就好啦~