求一篇正儿八经的专门讲如何用lentivirus转染ES或者SSC的文献

ying

整个板块号称是研究如何转染ES，但看起来全都是讲如何包装病毒、如何做感受态之类的很基本的东西。有哪位达人手上有专门讲如何转染干细胞特别是ES或者SSC的文章？希望能包括如下一些内容：/ v( A& ~0 `# q: ?3 u' n
1，需要的病毒滴度；! f1 `9 j) x' Y4 I. K
2，ES（或SSC）的转染的目的基因（或RNA)promoter的选取的特殊性，和各个promoter的强弱关系（CMV，EF1a,CAG,H1,U6等）和它们的适用情况；; T! D$ l6 y  @9 k# X
3，与基因表达后被细胞沉默相关的知识，比如说CMV转到ES之后会沉默但细胞分化后会重新开启吗？. P. J, q( f2 |5 W$ G" d
4，用何种protocol转染，具体程序，包括如何铺细胞，加不加MEF做feeder，加不加polybrane，转染几个小时，转后何时换液，最后何时检测阳性细胞，第一次转染一种ES的时候各种条件怎么摸（哪些条件要摸个小梯度），如何用药物筛选阳性（包括如何做药物浓度的曲线）；
) P+ g% Z  X9 ~1 Q5，各种trouble shooting。2 L6 g, N- t. a: [: J
期盼各位达人的指导。我是做SSC的，需要转染lentivirus。昨天在这里也看到一位网友要做这个实验。
4 W$ D! D3 O6 z( A我对做这一块非常没有经验，从文献和各个同学的反映来看，这一行的水也很深，鄙人觉得亚历山大～

ghfvcat

这个问题太大了，没看到有这么全的文章，你从公司买的话，倒可以仔细问问。0 Q9 V% D0 V* N
1：需要的滴度和细胞类型有关，一般给出的有效滴度都是以包装细胞如293T之类为靶细胞感染测量的，不同的靶细胞需要先测试下感染效率。以90%以上的阳性率为达标。7 H6 _2 i! n$ X% |- L
2：除非有文献报道说某个启动子不能使用，一般CMV,EF1a之类都是常用的。可以通过报道基因来看一下效率。
, H5 B! j1 ]7 |2 \3 G, b3：不清楚，CMV被沉默好像也不是百分百的，只是表达量稍低吧？
, [2 W2 H) B* K1 b. o' u2 N4：病毒进入靶细胞，不能叫转染了，应该叫感染。转染是前期包装病毒时的操作。至于feeder cell，最好在无饲养细胞的时候操作。polybrene是用来增加感染能力的，有一定细胞毒性，需要试试浓度，不加就能感染的话，就不要加了。药物筛选和普通细胞一样。# T' h+ o1 g# Z( R3 H
! R  E- P) A# _8 p, `

runsong

同求 帮顶

gact

ES中会感染病毒的，至于CMV沉默也有人提过，这方面的文献还没看到。。。

寒山拾得

ES中不同promoter 活性文献

chips100

前几天刚慢病毒做了个干扰，CMV驱动荧光，荧光有强有弱，选强的就行了，荧光看起来也挺好。
* {7 ^. c2 Z* E2 P) _5 n; P) Y( ]1，需要的病毒滴度；7 E% B7 d1 |  K% n; e) f
---------------直接病毒液转，不测滴度
7 E! ~+ {$ J# }  E, q8 U, ~2.和各个promoter的强弱关系（CMV，EF1a,CAG,H1,U6等）和它们的适用情况；
* ^* q* U% I0 ~0 v" J) @& ?----------个人以为绝对的强弱可能并不明显，可能跟插入位置有关，当然有人说EF1比较强。7 [* F2 }3 w' j6 H2 B
3.与基因表达后被细胞沉默相关的知识，比如说CMV转到ES之后会沉默但细胞分化后会重新开启吗？)
6 Z. B7 b9 y- n, U; T' H0 M----------沉默为什么会影响分化呢
, \+ A% `  g9 ?) U% D8 V4，用何种protocol转染，具体程序，包括如何铺细胞，加不加MEF做feeder，加不加polybrane，转染几个小时，转后何时换液，最后何时检测阳性细胞，第一次转染一种ES的时候各种条件怎么摸（哪些条件要摸个小梯度），如何用药物筛选阳性（包括如何做药物浓度的曲线）/ ?: r1 K" b% m7 T! T& \  u& w
------------------加mef，不加polybrene，当然推荐加8 |( T6 ?  V9 Z4 `
5 各种trouble shooting。1 C$ r4 V# R3 W; V4 K1 A
------------------没什么trouble