脂肪干细胞的提取问题

dxldeyou_2006

哪位高手知道提取脂肪干细胞的提取都需要哪些试剂啊？本人想做一次脂肪干，了解到一些试剂，胶原酶1是必须的吧?红细胞裂解缓冲液有需要吗？是不是用来终止酶的？

相宜

I型胶原酶，双抗，pbs，胰酶 EDTA  FBS，至于红细胞裂解液个人觉得不用也行，但是还要看自己呀

相宜

DMEM培养基，有的说用高糖，低糖和F12 这个楼主在多查查文献 选择下自己合适的吧

dxldeyou_2006

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: m2 v* ^, M  p! v# h( j" ]
请问EDTA是用来终止胶原酶的吗？要什么浓度？

dxldeyou_2006

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+ r+ h, `* ~+ D/ B4 f高糖低糖的培养基是干什么的哦？我在文献上都没看见过啊！

Demon_CN

1用抽脂机抽取脂肪，建议将脂肪颗粒打碎5 S; m1 a+ M/ j! W- L' b# u
2用 I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀（最好用振荡摇床）。
+ N+ Z9 b2 q0 m2 Y2 |3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。4 Y- `3 R0 q& V8 V5 k1 i% I
4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。/ W7 u& a8 Q+ h! y4 |
5 1000转离心10min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是脂肪干、还有其他细胞）, `0 |7 h: ]& d) |
离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，1000r10min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）
1 v" T* C! n* u' ]将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。
8 ?! V# h+ K: r' h& n6接种 按10000个cell/m2( f% i) c( F: ^
8 }2 @0 B+ A* a- Z
) n8 c3 \, e& {8 m3 s( H4 {- P" }* @
EDTA是用来辅助胰酶消化的不是用来终止的，终止消化用含蛋白量大的比如胰酶。5 _6 ~: k, _5 _$ ^
EDTA用来螯合二价离子，二价离子的存在会抑制胰酶活性
6 N% Q/ I: ^- g0 U1 U6 Z0 Z0 [/ i. ]* z4 B8 X
DMEM用低糖的，高糖会促进分化。
0 z' @/ o/ s6 U+ s) M# q5 x6 j高低糖的区别就是基础培养基含糖的不一样（低糖DMEM与葡萄糖为1100毫克/升，高糖DMEM为4500毫克每升，。）

owenlion

楼上的朋友们说的都可以，根据我的经验，IV型胶原酶也可以，消化时间也可以延长点。另外可以直接培养脂肪组织，也可以长出贴壁的MSC

荷荷

1.拿到脂肪组织后用生理盐水或者PBS洗至无血色，离心，弃上层液体；
& u6 K6 j" ^9 H9 m6 I2 C% J2.加入适量I型胶原酶，摇床220rpm 30分钟，观察脂肪组织成糜状即可；4 x+ c) H# x3 U4 F. Z& g# c
3.加入等量完全培养基（低糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗）终止消化；2 g( ^4 z6 Y5 [; U- Q* ~
4.离心或静止片刻，去除上层油脂，100微米滤器过滤；
& U9 @- [$ {0 R2 r4 Y5.1200rpm 8min，弃上清，加入pbs重悬，1200rpm 8min；+ q! z4 J# O$ q0 P2 r
6.弃上清，计数，1200rpm 8min；
- {, j6 R1 c( E  N7 ?7.接种 细胞密度10的6次方/毫升。
+ U2 H' U+ O9 p9 Y# L& S7 F' W# F$ V4 L4 K# d5 h$ M
注意：pbs清洗过程中尽可能的去除油滴；第5步离心后根据个人习惯选择是否红细胞裂解；

相宜

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& ?% g% b( q$ k, z5 n8 R
3 C( s, y% C* t1 ^8 J是一种螯合剂，一般你买的胰酶里面有含EDTA的，你可以先把EDTA的基础知识复习一下

相宜

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: P  ~+ M6 C$ i
学习了