核型分析求助

huangcong1988

昨天做了一次核型分析，基本步骤是：
+ o4 B1 I1 T, G2 I6 a1 ~7 J1.秋水仙素，终浓度0.1μg每ml，处理4个小时
+ [# M/ A. \  e* k2.吹起细胞，离心，弃上清
8 d  Z: u3 O8 K% H' x+ ?% f( `3.加入5ml 0.075M的氯化钾，37°，20min) H5 O4 [# I1 M% ?
4.加固定液1ml，离心，弃上清
3 l2 ]$ a! n/ Z: a- @+ i5.再加固定液5ml，静置20min，离心，弃上清  B5 w( ]" f# p: K, e7 Z" q
6.重复步骤5; p/ T8 y/ ~1 q! z% A7 X6 x
7.再加固定液1ml，将细胞悬浮1 V5 F. \8 T7 g; _- u
8。从﹣20取出预冷载玻片，于20cm高度滴两滴细胞悬液在玻片上，过火数次，干燥/ i2 `( D& v* \
9.giemsa染色，10min
& Y+ m8 |, s+ T1 B' Q0 y4 X10.二甲苯浸载玻片，晾干
' x, H+ `: M6 i8 z11，镜检5 k9 i% c  N" t9 U

9 s% y% X, P  [8 m4 U/ @- b: {' e几个问题：; ]' S& z& s  @8 r
1.第七步的细胞悬液要在﹣20里面保存备用吗？会结冰么？结冰怎么融？常温或者四度放置不行么？能放多久
1 n( Y8 j3 D5 e  P2.二甲苯浸漂的作用是什么？二甲苯什么功能？
# }" N* @) \! Z% j4 S7 I$ M3.制好的片子能不能直接显微镜 看，有的人说需要静置老化处理
5 u9 u9 t+ l/ {6 @) }9 p# K4.40×的为什么不能看清，我看了一下，看不出效果，一定要100倍油镜么？

myrudy

4度是可以存放，-20度是不会结冰。

ontheway_hit

1.第七步的细胞悬液室温就可以，为什么要放在﹣20呢。我做的时候就是室温。资料里也没有说要低温的。
3 }+ Z" S! L9 v8 V) V1 h7 x/ L2.二甲苯是使细胞透明度提高，具体我也不清楚。: ?6 ^3 b" @; n8 y1 l
3.可以直接看1 q  S, l% g8 z: ?9 y9 S2 b9 l8 L* h4 t
4.100倍油镜效果好。

YYQ6301

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7 B( x# o: y( x9 b6 r
' x: U! R. ~# @  r1、固定好的细胞可以放在4°C长期保存，没有必要放在-20°C
6 L+ i$ _9 m& Z% o$ w' N  T& H2、二甲苯浸泡可以增加细胞的透明度$ |' i" S6 Y/ B$ f) Z0 v
3、片子是可以直接看的，老化是为了显带0 A1 N: f. n3 y1 A: C; j
4、100倍的油镜可以观察清晰

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子6 h! s( K: k# G$ \% ]7 w9 b/ d

$ J/ m1 S# T$ W' `; ?  G用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

huangcong1988

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1 D$ _6 W1 x; Q! A
+ C& l" m  z- r/ L用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

YYQ6301

我们都是胰酶消化后离心，整个过程离心都能看到沉淀的，你的会不会是低渗作用时间太长了呢

huangcong1988

回复 ontheway_hit 的帖子( A. o- }% ~/ D1 f4 J' [( q& v
' i2 X9 x! W$ Q1 t3 o+ e2 v
还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

huangcong1988

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* X& ~. n* ^% \7 r0 E, t
还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

ontheway_hit

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: Q: t1 }. M& U' _9 `, P! w1 Z+ S- N2 \% B
称取10mg秋水仙素，溶解于100ml生理盐水中，即为100μlg/ml，过滤除菌，分装到1.5mlEP管，-20度保存。一般的介绍里就是这么配的。你一次把1g秋水仙素都用了，是不是太浪费了？估计没人会这么配的。