请教各位人外周血NK细胞分离培养应用于临床流程及加些什么因子？加多少？

jack063@163.com

我从事动物细胞培养几年了，现接触到了NK免疫细胞，我们目前只是简单的淋巴细胞分离液密度梯度离心---细胞刺激因子包被好的t25瓶子5天左右---t75瓶子2天左右---CO2bag5左右--收获制剂。培养基用的日本进口产品因子是加好的.如果有人做这行业请发表一下你们的流程和所加因子。

jack063@163.com

感谢大家的关注！

lunyuyuanxj

你包被的是什么种类刺激因子呢？效果如何，最后NK细胞比例、扩增倍数一般能达到多少？
0 A" f: W' q6 X据了解一般如IL-12、15、18等单独或联合刺激对NK细胞培养均效果不是很好，扩增倍数较低。
, A% c) B8 e2 I% U9 ?0 \( B国外研究多应用额外的刺激因素，如K562细胞经基因改造细胞膜外表达IL-15等，报道取得的效果较好，但国内一般的医院无法实现该目的。

andylee824

看到一个非常好的培养NK的方案，此文是2011年年底发表的文章，应该是最优化的方案。链接：http://www.jove.com/video/2540/e ... eral-blood-nk-cells
' ?9 H- o' t! P& `! a5 v7 v, |  ?9 y  h! \, a
（1）分离方案是 RosetteSep purification protocol 或者直接用PBMCs 。
4 n% z. K1 R9 ~9 l* L  k0 y（2）细胞因子用 IL-2.- P- l+ U- U# w8 y$ x3 f0 c
（3）饲养层细胞是 K562 Cl9 mIL21 ， 该饲养层细胞上嵌合 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15) （4）扩增效率可以达到“21,000-fold expansion in 21 days”。( [& q- x1 h, H
（5）培养基用的是 NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)，文中有配方。

andylee824

  作者单位是Division of Pediatrics, MD Anderson Cancer Center - University of Texas。有PDF的文献，也有video的讲解。其中他用到的饲养层细胞 K562 Cl9 mIL21 ，在下面的跟帖中有人提到了可否获取，他回应说 “该细胞系已经在US 以及国外分享，可以和他电邮联系”。我跟他联系后，他说可以给，但是海关那边有点问题，就搁浅了。不知道国内有谁用过这个饲养层细胞吗，我一直在寻找

lunyuyuanxj

回复 andylee824 的帖子/ }4 O: i) W1 c4 ?$ w9 r; W

0 o4 l) P( Q" I1 z& @4 p: T这篇文献我也看了，有两点感受：
# Q% P  [; P' j/ ?1、至少在我处的这个条件下，做不出这种细胞；
4 r8 q  ~+ y# }- ?- M2、整个过程太过于复杂繁琐；
, i- }8 v1 s$ T6 W3 P, a- u* O3、如果经改造过的K562细胞未完全消除是否会对人体有伤害。

zuming

回复 jack063@163.com 的帖子
! V/ R" Z! l6 i
3 U! U; H( V! v5 R" y我也用过日本的这套产品，其实扩增结果还是不错的。但是nk的纯度好像不够好。

jack063@163.com

我们目前还是用的日本全套技术，扩增效果确实不错14天左右能达到109，不过确实像你在最后收获的时候纯度不够好。
1 s2 g) e& u$ R, \日本鬼子说了几点：
+ W' B4 j% [- @1 w/ E: o1.由于采集的是患者的外周血所以每个人的疾病史或许是不一样的，比如有些经过化疗的病人就会有异同，还有一些乙肝患者免疫细胞生长就会相对快些。
% V5 `! }( V7 I0 X7 a7 Z9 o2.这个跟我们操作时传代的时机有关系和细胞生长多少，生长到什么状态阶段去传代这个是个经验活很难文字描述的清楚，具体问题具体分析吧。
5 S6 ]0 U$ v% \; i4 o

jack063@163.com

除了IL-2第二次加的是第一次的10倍外，我们还没得到任何信息，包被液也不告送我们是什么 150wRMB的技术转让费啊换回来一堆培养基。

jack063@163.com

哪天要是培养基断货了我们这实验室就得散伙了