琼脂糖凝胶电泳

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【实验目的】
* s* U+ q! h* v" N4 s) a% ^# {8 S（1） 学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
' V( x' s1 `# A- `! h（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；
6 i. R% c$ K2 Z: u9 V（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。# l6 y3 G3 j6 v2 W8 j# P
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【实验原理】 ) v& L0 `9 x  W/ o* F3 g# I
琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：
+ m# h1 h) Y; {9 k3 {（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
) i5 d% F0 x- j2 q' b（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。- a/ o' Z& j1 d7 K- A
（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
# F3 e, d/ W9 B  y) R（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。* x6 x; T) _0 y% m3 G) g6 P1 G$ ^" R
溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。  U- L0 \: A8 K2 e
常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。- F4 C+ I  s& Z- i
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【试剂与器材】
( q/ A( g- q" S（一）材料
: u1 w2 f2 a7 |1 ~0 M电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等
% ]8 ]" x; ]9 }; Y（二）试剂9 J8 E! p* N  ~+ ?: O
1、 50?TAE(1000mL)：242g Tris,
; g* x$ v4 x5 F8 A57.1mL 冰醋酸，
: u* N9 F2 v( f; u8 n& c18.6g EDTA。
  S/ v# _) q/ h* _0 e2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。# ?# L- \. d& C3 C- ~
3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。
$ U8 T  _4 d2 x: N$ b2 o4、 RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。
. f" r: I4 Y7 \4 J- _: A+ u5、 5?甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM醋酸钠，5mM EDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。1 o! C; x+ m4 p

; ]- N! m+ p3 ]7 |【操作方法】 4 ]% i8 J" G2 O4 L1 J: ~/ X
（一）常规的水平式琼脂糖电泳$ {! Q& F" o. j) N. q
制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：
: o/ U# o( Q& D. M5 Z9 ^琼脂糖的含量（%） 分离线状DNA分子的有效范围（Kb）- R9 F  k9 `$ x) N6 A
0.3 60-57 l7 `; F* c, y: O. A
0.6 20-17 F- o! f" M3 u. D: z
0.7 10-0.8$ I: \" j1 z) N: `
0.9 7-0.5
$ C- o" G3 |* F$ I* V! X3 v# K0 C1.2 6-0.4
+ I. b$ I! K& H/ A& C$ u- m; F. }1.5 4-0.2/ I6 C$ O5 Z2 m0 U7 p6 o6 _! X
2.0 3-0.19 |0 ]/ ^" @2 v, h+ M
7 u2 n3 X- @+ n7 m6 @1 O
1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
7 Z/ [3 J7 |6 ]4 U# y2．胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；
8 B3 {& \$ s( S9 U' y" B& Q3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。& i. e* T6 {* `4 J5 U& |: I
4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
; c4 e: r, C4 W$ r* m5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。
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* c  V$ ~" I* H& L3 V/ ?（二） 在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）
. q: `. M0 }5 x; Z; c  n5 V配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。
( v% O- T; {  g. I% w- b  z, d/ j甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲醛0.7μL，甲酰胺2μL，65oC加热15min，迅速冰浴，加1μL上样缓冲液和0.2μL的EB。5 w7 Z/ K2 [: @# r: ~" X3 B* M
步骤：* \6 [% m1 t$ e- E- g! G
1． 用3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上。
) @. S1 r  P) q4 H- I; U; A* T2． 胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。: ]; R' m" R# q4 s2 d3 |% M
3． 预电泳：1×甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳10 min。电压为5V/cm。. g  N! ^8 j7 Z( d, f
4． 小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。. R% p3 `$ d; u' _6 v$ W
5． 观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。
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【注意事项与提示】 / z- E0 X" i. i+ s
（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。" q6 k. Z& I, l) ?
（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。
, i1 q. [/ K4 g, x8 Y（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有部分降解，如果28S和18S rRNA大部分已降解，则需重新制备。
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【实验安排】
9 _. v- @+ w- q3 m8 I只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。
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