PCR克隆基因酶切的问题

linzi214

首先要检测一下PCR产物有没有扩增成功，将PCR产物凝胶电泳纯化回收后再酶切；另外酶切位点是不是特异的，会不会有多个酶切位点呢？酶切后得到的片段多大，会不会凝胶浓度太低或者电泳时间太长跑出去了？

runsong

是你的PCR产物加得太少了

daviddow

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4 J! ~# \  k4 G5 A1 T' M2 A4 {6 [- r
谢谢youzi821了。我的buffer是网站上介绍的，就是用BamH1 buffer.

daviddow

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PCR产物正确，我没有纯化，就是沉淀了一下，然后开始酶切。根据NTI VECTOR没有发现有其他的酶切位点。酶切后1200bp. 琼脂让电泳么有跑出去，就是都酶切了。

daviddow

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! o  v) R. i- K2 g+ I$ L, G: }+ s% o; b& p0 Y; G5 I3 m
1200bp

zxcv12345

回复 daviddow 的帖子6 L, _8 r7 w8 `% S2 N+ W4 j
1 [: }. p. W4 C, U( b  B0 K6 e
感觉是你在沉淀过程弄丢了，
  w( U& ]- m6 n. s; f建议先不沉淀，直接电泳看看。: Z, K$ d9 S* `! f' ^" j" s  @

0 _3 A* {. z7 V- B/ }6 W

lcxlorna

在做酶切之前应该先跑个电泳确定PCR产物有没有，浓度多大。另外，两种酶如果不是共buffer酶是不能同时切的。即使同时切也应该有一个条带，PCR产物也应该有条带呀？是不是电源插反了或者胶放错方向了，有人犯过这种错误。

linzi214

回复 daviddow 的帖子. H6 V) z7 w6 i4 u
" h( _! t. Z4 J$ C/ h
PCR产物的量够多吗？因为纯化会损失。我们一般酶切至少扩50ul体系，切胶纯化后全部用来酶切。切胶纯化一来可以看扩增产物量够不够，其次还可以去除其他非特异的条带（因为是整个基因组作为模板，多少会有些非特异扩增的，即使你看不到条带）。酶切回收次数越多，产物会损失越多，所以一开始就要保证有足够的PCR产物用来酶切。

weiyepan

你酶也加太多了吧，PCR条带很浓么？两个都是有星活性的酶，减少到1/5用差不多，而且体系这么大，看不到条带很正常。。。

daviddow

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4 {. A0 G0 [1 n' ^: i4 [; I
. \# P' b2 l1 z4 m$ \谢谢wei，我下次按你的建议做做，谢谢