PCR克隆基因酶切的问题

daviddow

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4 G( }4 u$ q3 P$ r& G7 [0 p* c( S- v: J/ I
我也用的是50ul的反应体系，谢谢你的建议

c05241037

没有目的条带只有100bp的？这个大小应该是引物二聚体，没有出现弥散条带的话产物降解可能性非常小，降解通常会出现彗星感smear，你有没有跑PCR产物？建议跑胶PCR产物。

daviddow

回复 c05241037 的帖子, Q( Y$ `5 M; w: _1 ~; J! @/ K
: i9 h* G$ h0 x1 X
我跑了，是1200bp，很好。就是酶切以后，出现了问题。

c05241037

给你说说我以前的克隆吧，
' b: {. P2 d" i- d  G, XPCR 体系50ul、30循环，1 L5 Y9 w/ ~- ~9 d- e$ ]( E. ^6 r
PCR跑胶3ul其余全部纯化（MP或者Omiga的试剂盒，主要是去掉PCR体系中的酶buffer等），纯化得15-20ul，9 m6 ^/ P* M# V" r% b! z; Y
双酶切50ul体系（纯化的PCR产物全部酶切，HIND3、BamH1用1.5ul），37度60min，跑胶纯化得8-10ul
' l4 F! k: k3 k$ R3 t) ^; l6 ~* ~一般PCR产物都是要纯化后酶切，目前还没有沉淀就酶切的经验8 S" E0 H# K8 ]# G! H# _- D
我以前碰到的酶切降解情况是因为试剂中有污染，比如buffer、水、或者其他？酶切中的试剂污染到DNAse，建议换试剂或者做验证试验看看污染源。

c05241037

给你说说我以前的克隆吧，
. {; N( ]$ ?/ j) v+ y) u, QPCR 体系50ul、30循环，
. _$ N* g! h( O8 x$ M- fPCR跑胶3ul其余全部纯化（MP或者Omiga的试剂盒，主要是去掉PCR体系中的酶buffer等），纯化得15-20ul，
0 O! [7 @9 ?8 O, D' i双酶切50ul体系（纯化的PCR产物全部酶切，HIND3、BamH1用1.5ul），37度60min，跑胶纯化得8-10ul9 E3 O/ u8 K4 w* p. Q
一般PCR产物都是要纯化后酶切，目前还没有沉淀就酶切的经验
( ^! b9 a6 C' }/ B4 t9 _我以前碰到的酶切降解情况是因为试剂中有污染，比如buffer、水、或者其他？酶切中的试剂污染到DNAse，建议换试剂或者做验证试验看看污染源。

daviddow

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' T/ [  ]  v7 F( c2 V: D$ C. @, y0 n" u6 X# ^
谢谢c05241037 ，不知道你用的内切酶是哪个公司的？