PCR克隆基因酶切的问题

daviddow

如何解决酶切后没有条带的问题？
9 `1 ~8 A8 G# {! V3 ?$ y# uPCR产物：N427 Q' G9 Q: [5 }* S- T6 p1 `

# S( W0 Z1 ^+ d. O, C, h3 p7 C+ n2 V( ^" u1 O1 f2 T
酶切后：PCR-N4-BamH
* t2 |/ ^% j; N+ g$ n$ E2 Z7 ^$ y! ]

& C" S, I- ?  W0 }0 i
5 j2 C1 p6 o1 L/ i3 U" [' x酶切的条件是：! I' A$ I6 Z, _+ C
Nuclease free water     40ul
/ D6 ?/ S, H  J1 @; J% Y+ [BamHI Buffer          5ul' {) [0 i1 f! N9 _! X! \9 E- {
PCR product           ul
2 u" Q" C5 m& ?/ d  PBamHI               2.5ul$ \  G5 r' W0 L- t8 W# ?
HindIII               2.5ul
0 ^" C0 B1 B9 T8 d7 h  z8 v②: mix gently and spin down for a few minutes;
0 |' ^* P9 d/ W9 L③: incubate at 37°for 3hours
3 U+ A% C0 ]. a) B4 X/ w) @

刘森泉

通过酶切其他载体检测酶是否有问题；通过PCR检测载体是否有问题；第三就是酶切反应了，这样的体系一般没有问题，因为你的BamHI Buffer不适合切HindIII，至少单酶切可以成功，一条条带至少应该有。

风雪叶杰

酶切之后没有条带？建议先检测下酶的质量问题吧，还有buffer。就算切不开也不至于把片段弄没了，只有可能是降解了，这两个酶都挺好用 的，不会有什么大的星活性

b6122

3 ~8 Q; |0 ?. I7 k" w3 Y, x1 W  Y% U
我切bamhi和hindiii的时候用的neb的buffer 2 （10x），我在网上搜了一下，配方如下：' s! g( F* S* C* a. T( {7 [
1X NEBuffer 2:
* S9 P) F' }. |+ F% z50 mM NaCl
# O" a$ U3 R2 c& C6 a6 P3 `10 mM Tris-HCl
4 P+ u; J* G& l8 E8 z6 ]! @10 mM MgCl2
0 H: O  u& k3 W& V6 y3 ^. B1 mM Dithiothreitol
( b+ s" a- p6 l) I$ \4 j0 u6 s- m) }+ spH 7.9 @ 25°C) v, p' g, {% g- w
这个buffer条件下，两种酶的活性都最高: F5 ^( t2 a" c& ^) T

2 A! [7 |' I8 O( p另外，你pcr产物跑电泳后回收胶有没有问题？

daviddow

b6,你说的回收胶有什么问题？不知道什么意思？谢谢！我是沉淀了一下就酶切，没有跑胶。

daviddow

回复 daviddow 的帖子. x6 w7 C5 `& D7 I- s
, g0 Q$ D8 @' M7 t- }
我的是fermentas公司的内切酶，这是他们推荐的内切酶。我切了质粒以后没问题，但是PCR酶切后就没有我需呀的条带了，都到了100bp一下了

daviddow

回复 风雪叶杰 的帖子
( h7 I2 n' [/ I: G4 {0 i% y% V# v# l
谢谢风雪，不知道哪些可以降解PCR产物？我的质粒没有问题，就是PCR产物都降解了

lazyworm

即使酶切没切开也应该有一条带吧，一点东西都没有要考虑前面的实验是否成功了。

youzi821

回复 daviddow 的帖子5 k8 L4 O& g+ E; O* Z5 ~
% [" S# p5 s  p9 ?( n
fermentas的酶，你看下酶的最适孵育条件和时间，超过30分钟，BamHI有其它活性，最近我也遇到这个问题，把酶切时间缩短，如果是快速酶的话，15分钟左右就可以，不要孵育那么长时间。

youzi821

而且一般情况下双酶切需要用通用buffer，请按照你买的试剂公司的条件来做。