关于CTL杀伤活性的体外检测

wagumaxida

最经典、直接的CTL杀伤活性测定的方法是Cr51释放实验，但由于涉及同位素标记和检测，大多数实验室做不了；LDH释放实验是否能够代替呢，有成熟的试剂盒，但为什么即使是最新的文献也大多采用Cr51释放实验检测CTL杀伤活性，LDH释放实验有什么明显的不足之处吗，请教各位高手# O, a8 z) t6 {' \  L# c/ e; \& _
另外，其他一些方法如ELISPOT、流式、ICS等检测的毕竟只是分泌细胞因子的淋巴细胞从而间接反应其功能（可能具有CTL效应），而以上两种方法是直接检测CTL杀伤效应功能的。不知各位业内高手有何看法 另外elisa检测IFN-γ的释放是否也可以呢？

Roden

最近看了篇blood文献有一种叫做钙黄绿素释放测定的。; O; l( t# s( D5 C. O
http://www.dojindo.cn/products/C/calceinam.htm
* I& O  t! D* \, L4 @' ]! SCalcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。另外，使用了Calcein(钙黄绿素)的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein(钙黄绿素)的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。
) X; q; Y$ X; Q; X# B$ ACalcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)能发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein(钙黄绿素)和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和碘化丙啶（PI）经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
7 z- P: y. C* {8 Q/ j  r2 g由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。
% V. H$ ?4 Q' `6 X
2 X5 m7 x0 V9 S: t

莫邪小仙

( R" O" N$ @- ]
5 B5 B# Y3 R! Y  F附上一篇用Calcein-AM荧光染色方法进行染色的文章，主要是对CIK细胞进行杀伤性测定，文章中有具体的试验步骤和结果分析。