大家帮我看看我的原代大鼠MSC

huajie881026

zmm 发表于 2012-7-18 10:25 ! H: L" e8 d# `3 e# i' H8 T8 t
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3 h$ e7 P( L: H( h5 o+ @0 @! H# B8 M! T* K& L" q
应该会有集落，因为你用全骨髓的话，杂细胞会很多，所以可能形成集落。那你的操 ...

4 b' ^- l+ z( E取健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（鼠龄6-8周，体重150-200g），颈椎脱臼处死，置于浓度为75%的酒精中完全浸泡5min。用无菌镊将大鼠放在无菌大培养皿中，放入超净工作台内，剪开大鼠皮肤和肌肉组织，取出股骨和胫骨，放入盛有含1%双抗液的PBS的培养皿中。将附着在骨头上的肌肉、筋膜等组织尽可能的去除干净。将股骨和胫骨转移到DMEM-LG培养基的培养皿中，用无菌镊夹起骨头，剪断胫骨和股骨两端。用2ml注射器吸取完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基），迅速反复冲洗骨髓腔（冲洗液另用一无菌培养皿接住，骨头不与冲洗液接触），直至骨髓腔发白。用吸管将冲洗出来的细胞反复吹打混匀，200目滤网过滤除去大块杂质和组织，制成细胞悬液。将制成的细胞悬液用吸管移入无菌离心管内，配平离心机，1000rpm，4℃，离心5min。 吸管小心吸弃上清液，加入适量完全培养基到离心管内，混匀重悬细胞,接种于T-25的塑料培养瓶中，置于37℃，5%CO2恒温孵箱中培养。48h后全量换液。小心吸弃上半层培养基，加入等量新完全培养基，继续培养。以后每3天全量换液一次。
! k0 E- a5 B4 T) l目前就做到这一步，求教我哪一步出问题了呢？
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dyg108

才5天，也不能说失败，过几天也有可能会形成集落，毕竟骨髓中MSC含量是非常少的。
! r$ G8 P1 f% X1 h按照你的操作方法有几点应该注意：
, u' P) J! }- a4 h# N3 e1、操作速度，从处死到得到细胞的时间越短越好；
0 ~# f' t: y( A& Z+ E, Z2、动作幅度，操作过程中动作幅度不能太大，尤其是冲骨髓的时候，用力过猛损伤会比较严重；9 k/ k8 v8 _) n- S' t
3，可以省略过滤，骨髓中MSC本来就少，所以尽量减少再过程中的损失，过滤就可以省掉啦，因为传代和换液的过程中一些大块的组织自然会被丢掉

franklinhg

一只成年的SD大鼠的两后肢完全可以接种一个T75的瓶子了。 不知你用的滤网是那种一次性的塑料的还是不锈钢的？ 一次性的塑料的滤网容易吸附了MSC，这个我有过失败的经验。 多数MSC在塑料滤网上，没有下来。  去年在喜欢喝咖啡的国内的所谓国际大都市参加的一个会议上，有人也报道了这个现象，并且好像是以此滤网为支架，诱导向软骨分化（时间有点长了，当时也没有注意听。。。）。希望有所帮助！

huajie881026

franklinhg 发表于 2012-7-18 13:23 4 i' D' i1 i" h% L  o* ?3 j
一只成年的SD大鼠的两后肢完全可以接种一个T75的瓶子了。 不知你用的滤网是那种一次性的塑料的还是不锈钢的 ...

& U3 ], M# \  o. D. L6 p0 ]我用的是200目的不锈钢滤网啊，应该不会有很多细胞在这个滤网上吧，难道要将滤网再冲洗，把细胞冲下去？

星火燎原

可以试试用ficoll分离一下先，再中瓶，一只中两个T25,三四天就能看到小的集落

飞翔的十字架

我觉得7周龄的实在大了点，3-4周比较合适

huajie881026

dyg108 发表于 2012-7-18 11:21
, d' d$ W) o( n! c! d, n: z才5天，也不能说失败，过几天也有可能会形成集落，毕竟骨髓中MSC含量是非常少的。
% _; B+ V* A- D, ~7 y$ d# b按照你的操作方法有几点 ...

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嗯，如果再做，我会注意这些的，谢谢啦!

huajie881026

星火燎原 发表于 2012-7-18 21:48
. s' M! v% ?5 W: Z5 p+ R可以试试用ficoll分离一下先，再中瓶，一只中两个T25,三四天就能看到小的集落

. e# g, Q1 q* I0 `5 Q是说我现在的细胞再用ficoll分离一下吗？

huajie881026

飞翔的十字架 发表于 2012-7-18 23:00 2 y- J% D$ p$ c$ `1 D+ U$ J
我觉得7周龄的实在大了点，3-4周比较合适

0 _) f3 [  k) J. M- i. M) }7 \
7周龄大吗？我看文献多是6到8周啊，也有4到6周的，是因为周龄太大，所以MSC少然后不好养？

飞翔的十字架

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! b$ N+ A( D& K8 Q: a  D$ H' l) i/ p1 O- [
随着周龄变大，MSC在骨髓中的比例会下降，但是骨髓总的细胞数量会有一个增长然后到平台。文献确实有8周的，但我自己的经验，3-4周的比较好