分子克隆：现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功

lugu167

我以前也做过单切连接 也出现了载体自连做不出的情况 后来换用双酶切连接 很容易就做出来了 实在不行 重新设计 用双酶切吧

pailishi

试试NEB的酶吧，我用了几年，这个分子克隆完全没问题的啊

刘森泉

回复 yaolinzhang 的帖子" o& d8 B+ d& k9 [; ]$ N# h
+ s1 S% Z& o8 m
太巧了，我在做一个克隆，情况跟你一模一样啊，载体单酶切自连接，双酶切连接目的片段都没有成功，但是空载体转化长得很好。一直找不到原因，我都想把目的片段P出来连T载体去测序了。无语啊。

yaolinzhang

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" K1 `$ X) A5 l3 p
# |4 Q/ ]& q; P, R( I  |连接酶用了三个不同的公司都不行；对照一直有

yaolinzhang

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* |* \2 f# ?) h! g1 g
- c7 O* B1 ]/ ]( T/ O我在做造血干，好像你也在做。是吗

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子# \+ {$ i" p; ?! D  `3 r) G

/ x0 h. h* D* S+ a- y$ k) k* e不好意思，权限限制，不能给你留言

weiyepan

回复 yaolinzhang 的帖子: _" I! ?3 g: f) L7 Q* R
7 M5 n. Y5 s6 q
切完载体之后有cleanup过么？& E! z! x3 T) z
T4 ligase对盐浓度比较敏感，如果你使用的高盐的酶切buffer就要先做个cleanup，不要直接在里面连。3 c& s- ~  c4 ?
另外可能是有质粒有外切酶污染，建议酶切之前80度煮个10分钟再加酶。0 j3 }. @7 q: n7 v) U
最后一个最简单的可能，你片段保证是有磷酸末端的吧？

刘森泉

回复 weiyepan 的帖子' T, S# Z, p* T

% _1 M: p4 M6 y# {+ e/ [9 m4 Z一般载体切完都是跑胶回收的，而且用水溶的。/ T" H7 s1 l( U! D2 Y
PCR产物是用高保真酶做的，应该会有磷酸末端吧，具体有没有怎么鉴定啊？

刘森泉

回复 yaolinzhang 的帖子* E$ {0 X+ t2 x2 u
9 _; }/ V& k/ e; a
你造血是做什么方面的呢？我做多能干向造血分化，以后多交流哈。

yaolinzhang

和你差不多，好的