泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

sunflower636

    在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。
0 Z9 A/ J' S+ `1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）4 R" u* J* `; q$ O
2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。. h8 ]$ r1 R; p
3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。
; U7 P  P5 H" |8 r$ `" m5 b  g4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。3 `6 v$ {; v; I* W, n& R1 k5 |
5.离心，1300转离心10分钟。' @( b4 F; s2 G- i
6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。1 s  e) {6 D( h5 ?& h6 M5 a
7.离心，再离心1300转，10分钟。
5 t( e8 S: K- e% b0 ~7 G8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。
+ V% z# K) L9 l5 G9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。6 h" d0 ?9 A3 W# K

; T1 F- ]) K4 X+ ?0 X  i- m" t/ U8 U9 {! ^
以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知 道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

Tim

回复 sunflower636 的帖子1 G! X* Q* \3 L1 W; a$ W& k

7 \; \6 `5 I! J8 ~9 g, y2 s离心的转速比较高！时间比较长

sunflower636

回复 Tim 的帖子
( X/ {" A( e: |! k
* O3 T% T3 _0 y; b9 Y0 Q那一般用多大速度离心合适呢？1000转？5分钟吗？但是这样我也试过，但是离心管底没有看到细胞沉淀啊。

evial

: [8 m: h/ G( G0 Z
( A8 q% b/ m2 ^' o. X6 p9 U3 X
你要190太快了，细胞都摇碎了，你当要细菌啊！

loyal

300g，3min

evial

5 z( O, o5 B" f, t, |# n

- ?2 J6 ^" A2 _小于2000转对细胞都是安全的，不同离心机轴不一样转速就没有可比性，一般用G来统一，有时300g相当于1200-1300转。细胞小的话离心时间长一点最长的15分钟也没有问题，一般5分钟可以把细胞离心下来。所以你的离心参数没有问题。
- F8 d7 ?* n2 C! D你的第五步，加过什么东西然后离心么？

sunflower636

回复 evial 的帖子
$ l( ~" \& t" Q) X: V  f8 [; H, M0 {
没有，我看消化成糊状就直接用离心机离心了。有的说要加血清终止消化，但是我查文献其实血清终止不了胶原酶的消化作用就直接没有加，离心了。

sunflower636

回复 evial 的帖子
2 l6 H5 S0 ~" a' C" h
" Z0 x8 ?, x9 w- w$ Z" I5 M: g, z是吗？那你们都用的是多少转呢？文献里这是正常范围啊。最高还200

sunflower636

回复 loyal 的帖子
' H/ J4 ^7 ?$ a$ s6 H/ @* C8 M) o1 O1 \& _
3分钟？？？会有细胞沉淀下来吗？

stemcellmeng

这个一开始胶原酶消化的时候，其实放在37℃的恒温培养箱中，过个5分钟点到几次就可以，一般这样就可以把细胞消化下来，不需要摇成糊状。应该是你能看到脂肪细胞消化完之后仍然留在上层，但是在下层会有ADMSC的沉淀，这样就可以了。离心的话一般800g即可。还有，你的脂肪的来源部位也有关系，一般是腹部皮下脂肪或者抽脂手术的好一些~