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楼主: qiugt0819
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ficoll淋巴分离液分析骨髓间充质干细胞   [复制链接]

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发表于 2012-8-25 09:04 |只看该作者
1."稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的",你这一步改成用移液器,选一个口粗的的巴斯德管,沿着管壁慢慢加到ficoll液上,管子稍微倾斜,加完后再垂直过来,操作要慢;
5 f7 S  f* g. }4 g  ?$ `5 `2.最后那部离心转速要加大到1500-2000rpm,时间也延长,单核细胞毕竟较小。
4 r( J. H' U8 s5 z! _9 e, F7 _& ^7 K3.骨髓冲洗过程再仔细点。试试。
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发表于 2012-8-25 22:10 |只看该作者
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! h( P) |) ?. H+ u1 r% @& ~6 W2 o4 G+ w
好的,谢谢,下周再试一次,希望能有好结果

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发表于 2012-8-25 23:57 |只看该作者
感觉标本量相对有点少,所以白膜层才会不明显
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发表于 2012-8-26 11:08 |只看该作者
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回复 qiugt0819 的帖子
5 d: f' K" S: z& D5 z. I1 W2 M8 n( D
需要缓慢逐滴加入,越慢越好
7 Q0 v- R- w+ I. M+ q# f1 q0 v% P
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发表于 2012-8-26 20:38 |只看该作者
一般ficoll都是500G到700G,20到30min缓升缓降,尤其是减速度越慢越好啦。加样的时候可以用电动移液器5ml移液管,第一滴一定要加好,然后就会比较好加了。分离效果的好坏与细胞密度有关,但图片上看的话红细胞应该不多,所以应该不是细胞密度的关系。从图片上来看,没有明显的灰白层,分离效果相当差,如果分离效果好的话灰白层是很明显的。在这种情况下一般吸取红白层中间的那4ml(用15ml离心管),取2ml少了点。还有就是你才50个细胞,还用PBS洗一遍那细胞肯定就很少了的,离心得再好悬液中也会有很多细胞残留的。
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发表于 2012-8-27 09:12 |只看该作者
水平离心,离心力800G就可以了
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发表于 2012-8-27 13:12 |只看该作者
回复 qiugt0819 的帖子- R! P1 B9 F- G0 f

; k8 x! _/ O6 R+ V: T, e1. 建议稀释比例为: 小型猪骨髓:DEMEM:分离液=1:1:1
* m8 ^6 N) C* W1 ]; W8 p2. 你在加入稀释液的时候,先把装有淋巴细胞分离液的管子倾斜到一定的角度(45度角差不多,或者角度可以再小一点);然后再用加样枪加入稀释液(1毫升枪的冲力比较大,可以考虑用吸管或是将1毫升的枪头用无菌的剪刀剪去一小截,可以减缓冲力),小心加入后就可以形成临界面,之后再加起来就方便很多,第一下是最重要的!
) X! i: Q1 ^6 l) ?5 }# I3. 随后再配合前面说的转数(2000rpm)、温度(25摄氏度)和时间(20 min),相信你肯定能成功的,祝好运!
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发表于 2012-8-27 16:18 |只看该作者
淋巴细胞分离液如果效果不好,可以进行全髓培养,利用贴壁培养进行筛选MSC
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