ficoll淋巴分离液分析骨髓间充质干细胞

qiugt0819

，有明显的三层分层，但看不到传说中的狭窄白膜层，然后我在红白相间的地方抽取了约2ml液体（计数板每个视野约50个细胞），加pbs800转离心5min，弃上清，再细胞计数却发现没有几个细胞了。问题：没出现白膜层是否跟离心参数有关，加PBS离心是否因为2ml中有淋巴液，结果细胞又悬浮在上清液中被弃掉了呢，希望各位不吝赐教。

katysong

初步感觉应该是离心转数太小了，一般是2000rpm/20min/25度；而且一定要用慢升慢降的离心机；一般都能做得出来的，祝好运！
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wangzhiqi86

你计数发现视野只有50个肯定不正常，因为MSC占单核细胞的比例只有百万分之一，也就是说如果抽到的是白色层单核细胞，应该整个视野下面都是小的细胞，不知道你有没有这个照片。3 A. F! M: L) V. g0 S3 R; N
还有，你把骨髓冲出来的悬浮液加到ficoll里面，有没有具体的操作步骤，不然只给一张图片不能说明问题。
$ V  v8 c( E$ K# C  {上面的培养基颜色很红，不知道为何？我当时上面只有单单的红色，中间的白色层在轻轻晃动离心管后，明显随着一起摇动。

小猪快跑

转速太小，本来细胞量就少，转速还那么小，平时消化细胞离心的时候还得1200呢，淋巴分离怎么也得2000转吧！

qiugt0819

回复 katysong 的帖子8 R# @' U6 R$ f2 t- Y
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谢谢，第一次发帖，图片前面的文字没有显示，操作过程：小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1，转速3000R15min就出现图片的结果了，但是就没有明显的白膜层，不知3000R15min是否需要改进

qiugt0819

回复 小猪快跑 的帖子7 K5 [# c5 l+ Y* y# m* t
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谢谢，第一次发帖，图片前面的文字没有显示，操作过程：小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1，转速3000R15min就出现图片的结果了，但是就没有明显的白膜层，不知3000R15min是否需要改进，800转5min是想洗一遍细胞用的

qiugt0819

回复 wangzhiqi86 的帖子
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) n$ d& h5 z) |' W谢谢，第一次发帖，图片前面的文字没有显示，操作过程：小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1，转速3000R15min就出现图片的结果了，但是就没有明显的白膜层，不知3000R15min是否需要改进，细胞计数的图片没有保留，你的意思是单核细胞应该很多吗，那MSC形态与其他单核细胞一般怎样辨认呢？

wangzhiqi86

回复 qiugt0819 的帖子, ~) ^8 d; x# e# a; I! u5 ^) \
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稀释液是怎么加到Ficoll里面的？9 n3 g# P1 ^2 K( P) e7 _
单核细胞当然应该很多，换液后就可以发现MSC可以贴壁，其他细胞会被换掉，过几天就看到了

bsx1111

看图感觉你的骨髓细胞量太小了，细胞肯定要少，建议你用直径小一点的离心管试一试，再有离心机要用带缓降功能的，降速太快，层容易散。

qiugt0819

回复 wangzhiqi86 的帖子2 H/ q0 s0 h* ]: D# E( H
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稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的，但还是感觉会混到一块