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ficoll淋巴分离液分析骨髓间充质干细胞   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2012-8-24 13:15 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
,有明显的三层分层,但看不到传说中的狭窄白膜层,然后我在红白相间的地方抽取了约2ml液体(计数板每个视野约50个细胞),加pbs800转离心5min,弃上清,再细胞计数却发现没有几个细胞了。问题:没出现白膜层是否跟离心参数有关,加PBS离心是否因为2ml中有淋巴液,结果细胞又悬浮在上清液中被弃掉了呢,希望各位不吝赐教。
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沙发
发表于 2012-8-24 17:12 |只看该作者
初步感觉应该是离心转数太小了,一般是2000rpm/20min/25度;而且一定要用慢升慢降的离心机;一般都能做得出来的,祝好运!, F$ N% s; j; B6 @0 ?! V, a
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金话筒 优秀会员

藤椅
发表于 2012-8-24 17:36 |只看该作者
你计数发现视野只有50个肯定不正常,因为MSC占单核细胞的比例只有百万分之一,也就是说如果抽到的是白色层单核细胞,应该整个视野下面都是小的细胞,不知道你有没有这个照片。7 _9 c1 o0 w, {- t& e. G
还有,你把骨髓冲出来的悬浮液加到ficoll里面,有没有具体的操作步骤,不然只给一张图片不能说明问题。" I! D8 ?% w6 T1 F
上面的培养基颜色很红,不知道为何?我当时上面只有单单的红色,中间的白色层在轻轻晃动离心管后,明显随着一起摇动。
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板凳
发表于 2012-8-24 18:27 |只看该作者
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转速太小,本来细胞量就少,转速还那么小,平时消化细胞离心的时候还得1200呢,淋巴分离怎么也得2000转吧!
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报纸
发表于 2012-8-24 19:21 |只看该作者
回复 katysong 的帖子
" S6 `7 s$ n, j8 l* {; C! _4 H% U. W  r/ u0 y" U3 |/ r
谢谢,第一次发帖,图片前面的文字没有显示,操作过程:小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1,转速3000R15min就出现图片的结果了,但是就没有明显的白膜层,不知3000R15min是否需要改进
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地板
发表于 2012-8-24 19:22 |只看该作者
回复 小猪快跑 的帖子( S, M: t# Q! o( O
4 U8 L$ u) {; h4 J
谢谢,第一次发帖,图片前面的文字没有显示,操作过程:小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1,转速3000R15min就出现图片的结果了,但是就没有明显的白膜层,不知3000R15min是否需要改进,800转5min是想洗一遍细胞用的

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发表于 2012-8-24 19:28 |只看该作者
回复 wangzhiqi86 的帖子9 _( h; Q" S) L0 h$ \# `
8 Z3 c  ]' i2 O' }, A6 O" T2 f0 G9 L: g
谢谢,第一次发帖,图片前面的文字没有显示,操作过程:小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1,转速3000R15min就出现图片的结果了,但是就没有明显的白膜层,不知3000R15min是否需要改进,细胞计数的图片没有保留,你的意思是单核细胞应该很多吗,那MSC形态与其他单核细胞一般怎样辨认呢?

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金话筒 优秀会员

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发表于 2012-8-24 20:21 |只看该作者
回复 qiugt0819 的帖子
: j( {1 H% G! a# z- x8 f: ]0 s, |* n9 t5 @9 w& }. ?7 V3 z0 b
稀释液是怎么加到Ficoll里面的?
( g3 G7 H( N) m% v/ J* |% ?: W单核细胞当然应该很多,换液后就可以发现MSC可以贴壁,其他细胞会被换掉,过几天就看到了
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发表于 2012-8-24 22:28 |只看该作者
看图感觉你的骨髓细胞量太小了,细胞肯定要少,建议你用直径小一点的离心管试一试,再有离心机要用带缓降功能的,降速太快,层容易散。
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发表于 2012-8-25 00:50 |只看该作者
回复 wangzhiqi86 的帖子
8 b2 t$ X8 W" |8 t. f  M6 Q9 ?* D. \4 _. ~# ~5 y
稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的,但还是感觉会混到一块
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