western求助

daxi-fighting@1

% M, ]6 x0 ]* e# E( Z. Y我从今年八月份开始做western，也遇到了同样的问题，12,11kd的蛋白，用的3.03gtris，15.01g的甘氨酸，200ml甲醇，800ml的双蒸水配的转缓，90v，0.2um的PVDF膜，湿转转膜20min，做了很多次了，都快两个月了，都没做出来。着急啊，文章结果就差它了。请问做这种12kd的蛋白跑胶的时候有什么特别注意的吗？我都是配的15%的聚丙烯酰胺胶，电泳的时候你是跑到什么程度呢？是看着上样缓冲液不跑过夹子的绿色的线，不跑过玻璃板的最下端还是比这个更早就停止电泳吗？我每次看到10kd的marker转膜后都在膜上，可曝光的时候还是没有。连核内参H3.1（17kd）都没做出来，欲哭无泪啊。求助求助

Donnies

我们做western一般是用NC膜的，你的条带没有跑出来，一种情况你的蛋白表达量是不是太少了，还有一种情况是你的蛋白没有跑出来，另外你转膜用多久，我们实验室有一个同学跑10kd左右的，恒压60V转膜，时间为20-30min，还有一种情况你的抗体怎么样？

lazyworm

做western太多细节都要注意，太大太小的蛋白确实比较困难。首先，从你跑胶转膜来看没什么问题，你用丽春红染膜或者考马斯亮蓝染胶了吗，如果都没发现问题，那就要考虑一抗是否好用，浓度是否合适（比如1:500稀释，用了1:1000稀释），二抗是否对应准确（一抗什么来源，用抗什么的二抗），发光剂、显影液、定影液是否有效（是没有条带，但有非特异性带；还是什么都没有）。前些天听讲座，工程师说蛋白上样量不能太少但是也不是越多越好，30ug左右比较好。我后来试了下我做的蛋白，确实30ug比50ug结果漂亮。还有跑胶时，不要跑太过了，loading的蓝色线跑到分离胶2/3的位置就可以了，不知道对你有没有用，祝好运！

amphioxus

检测12kd的小分子蛋白电泳时间应该长一些，我用的内参为cofilin（约17kd），100v恒压在冰中电泳3h。“每次看到10kd的marker转膜后都在膜上，可曝光的时候还是没有。连核内参H3.1（17kd）都没做出来，”可能的原因可能有：1，没封闭好。封闭的作用是封闭膜上剩余的疏水结合位点，封闭不好，曝光后乌黑一片，什么也看不清，建议用5%的脱脂奶粉（TBS-T稀释）封闭，4度过夜。2,检查抗体，抗体还有效。有没有孵对抗体，内参和目的蛋白的膜要剪开，分别孵，有没有放错啊？3，抗体没洗干净。抗体孵育以后，一定要洗干净，否则曝光后还是看不清。4，重新配置显影底物，显影液，定影液。曝光时，X光片放在暗盒后，一定不能再晃。希望能对你的实验有所帮助。