猪脂肪干细胞的分离培养及诱导分化 很多问题都不懂

倔强的投手

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我最近在做猪脂肪干细胞的分离培养及诱导分化，由于是第一次做，很多问题都不懂：
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1 猪脂肪干细胞一般传几代之后就不能分化了？之前听师姐说，牛的传3代就不能再分化了。由于我没有对锁获得的细胞进行鉴定，其中可能肯定含有一部分的前脂肪细胞或者其他细胞。请问这种情况下，我一般可以用第几代的细胞进行诱导分化？
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& ]! i' J8 n# z* A2 p4 [3 \5 s1 U" m2 猪脂肪干细胞的接种密度一般是多少？我之前接种的密度是25000cells/cm2
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3 我用的诱导分化液是无血清的，还含有胰岛素、DEX、IBMX和Rosiglitazone，请问这种分化培养基可以吗？我看好多文献上面都是加血清的& |3 J/ i8 ^8 f$ G! R' z3 f1 a
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4 在诱导分化后第三天开始，我的细胞有好多都漂起来了，我用的是第三代的细胞，而且剩下的细胞液没有看见明显的脂滴，请问这是怎么回事？
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8 U" N) d0 D6 I7 K+ y1 V0 e这是我分离得到的细胞
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这是加诱导分化液之后1d的照片: H) r8 {, j) H  F* a+ R' P, X
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4 g& d0 l0 H( \  f7 J. I这是诱导分化第2d的照片$ l0 p7 {- @: n6 m

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+ i8 O3 B& z" _$ l3 T4 d这是第3天的，很多细胞开始飘起来了9 ~$ b* x) l; D9 w2 I* ]( ^

liyujuanmarry

1、你养的细胞状态不怎么好6 X: }2 X  _" m1 H7 l( u2 G1 }
2、可以看到你做过诱导分化后的细胞大都死了，所以会飘起来! `4 X& L' s* w2 ^! Q
3、可以考虑更改一下培养基配方

倔强的投手

回复 liyujuanmarry 的帖子" `4 L3 ~- ]  D' h
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1 其实加诱导分化液之前还是挺好的，很快就长满了，两天之后就差不多100%融合了。是不是在80-90%左右融合的时候就可以诱导分化了？* N4 N5 G* K4 w5 P4 F
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2 是的，我也认为很多细胞在诱导分化的过程中死亡了很多，应该怎解决这个问题呢？- Z' d4 x' b' d# W8 I. Z2 Q
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3 你说的是更改诱导分化培养基的配方？是不是加10%的FBS会比较好？

liyujuanmarry

一般情况下细胞长到100%融合的时候再处理已经晚了，细胞就很老了，可以在80-90%融合就处理。其实从你发的的第一张细胞图片就可以看出，你养的细胞状态很不好，正常情况下的脂肪干细胞应该是长梭形的，或许你在诱导之前的细胞培养液就不是很理想。

sunflower636

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猪和人的脂肪细胞有点不一样，我都养过。猪的脂肪细胞贴壁后出来就是这个样子，不是人的那种细长的梭形，我认为这不是细胞老化。

sunflower636

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+ d5 z+ Y9 P* \3 {* w4 D% m. k- L# T  }) }, k. k) G
应该是没有血清的缘故，可以把血清浓度控制得低点。2%到5%，试试。

倔强的投手

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6 R! s; ]+ q, s5 {5 D9 P8 w: I" R$ x7 H
那张不是诱导前的细胞，就是细胞生长过程中我拍的' K4 u: K" l! @* H% _1 ^* E
下面这张是诱导前拍的照片
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倔强的投手

回复 sunflower636 的帖子' |9 X8 k! \: C

% D6 w" ?7 h( |4 H我用的是第三代的细胞，不知道是不是有点老了，因为原代培养，本来就传不了很多代。
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6 J0 M8 O0 y, U2 C5 Q( l我也感觉可能是没有血清的缘故，本来诱导分化对洗吧就有一定的毒害作用，再加上无血清培养基中的应用成分可能也相对较少，所以才造成了细胞的大量死亡

深海鱼

为什么不加血清呢？三联诱导都是在10%血清里加的。话说你诱导人家成脂又不给营养，所以只能死给你看了

倔强的投手

回复 深海鱼 的帖子! s/ q. j$ l! ^. o- O  T) b/ n

# r2 ^% V7 x* y7 n/ \6 ^好吧，下次加FBS试试