肿瘤干细胞球消化问题，消化后不长

yxzxlmlf

    小弟最近在养干细胞球，我消化的步骤是这样的，大家看看有什么问题，谢谢！
) f/ ^* s1 s9 U3 s   1500rpm收集球体
" i4 n$ y4 |0 c. |& |   吸出培养基，加PBS吹洗9 W* G, W# o( n
   1500rpm离心吸出PBS
4 f7 J/ `+ d) Z3 a! S4 v3 }( f     加0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na 37℃消化两分钟% V3 y$ n- H. ?8 U' `
   1500rpm离心去除胰酶加培养基吹打成单细胞。
) r$ C, a$ q' {: w以上是步骤，但是过后就不长了，不出现球了

570505

不长是每个单细胞都不出现增殖吗？是不是消化时间太长了？

yxzxlmlf

回复 570505 的帖子6 ^3 o! J+ v% s6 ]0 y) a- R
5 F$ Y5 s% @  j% n* |
第一代有球体形成，消化后就都是单个细胞，没有细胞球了，我看有的人消化时间更久都可以

yxzxlmlf

自己顶一下，求大神之处错误啊！

monk125

跟消化没关系 跟你培养条件有关系 你再去查查你第一代之后用什么培液养的吧 千万别是纯培液

yxzxlmlf

回复 monk125 的帖子1 w, t# G" H- t- D$ J
' p* k2 F/ }9 Z4 X* B  ]
我用的DMEM/F12，加10ng/mL bFGF ， 20ng/mL EGF，  2%B27，  5μg/mL胰岛素

qq348940434

我想请问一下你养的什么细胞

yxzxlmlf

回复 qq348940434 的帖子* [' I& r: P1 I

7 @0 K: P8 q' n% G- lMCF-7

qq348940434

回复 yxzxlmlf 的帖子1 g$ g) \) D; Y7 r1 j- |+ |2 o9 y
. n# ^  ^9 Q& L7 A6 G
我记得上次看了一篇文章是这样说的“Sphere cells were then collected and dissociated enzymatically (15 min in 0.05% trypsin, 0.53 mm EDTA-4Naat 37˚C).

qq348940434

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5 j% X& t3 D, D0 s9 x2 }7 b$ ]; ]' N* z- g  z5 t# v: Y
对了 我想问问你那个成球实验怎么做的，我已经试过4种方法了，还是没养出来，细胞老是贴壁成膜。你是用的超低吸附的培养板，还是加了什么特殊的，我养的是甲状腺癌TT细胞和肝癌G2 两种细胞都不成球，我培养基里加了40ng/ml的EGF，40ng/ml的bFGF，2%的B27。