培养CIK，你用几个培养袋？你的细胞数量是多少？

weijunning

回复 lyj-0017 的帖子0 r& r; N7 S, D& X9 m* A/ v8 E
/ T+ Q2 [- e- O5 t
关于外周血分离出的PBMC，细胞数量都是很少的，一般在1~2*107之间；所以，我们这里对待外周血样本，一般都是将提取出PBMC全部用于CIK培养，将全部的PBMC铺在一个T175培养瓶中，细胞密度越大越好，这样才会刺激细胞快速生长，一般培养3~4天左右会进行收集计数，转入培养袋中进行扩增培养。至于你说的在T175培养瓶中贴壁培养2小时，你们是将外周血提取出的PBMC还用于DC的培养吗？这样的话，培养出的DC细胞数量很少，CIK细胞数量也上不去，不如将其全部用于CIK培养好。悬浮细胞层出现细胞聚集也没关系，收集下来进行CIK培养就可以了，CIK本来就是成团生长的。

lyj-0017

回复 aochongyu 的帖子
; I/ D4 m, _$ p' ]: t% L$ g7 Q# u1 j: o4 x0 z, h
什么叫蛋白细胞团黏连？- ^. K0 N3 Z4 \/ w
我在细胞铺瓶2小时后发现，部分患者的上清中会出现絮状物，显微镜下观察会发现基本就是细胞黏连在一起，怎么观察是不是蛋白引起的黏连呢？

lyj-0017

回复 weijunning 的帖子3 y1 }7 d/ P8 `6 n) u* q$ }- l

) \# i+ O+ M$ v* g1、你们采集多少外周血？分离得到的PBMC数量怎么会这么少呢？如果按照每ml外周血采集1X10^6 PBMC，100ml外周血差不多能得到1X10^8 PBMC啊。. b; p) D8 `) N1 b
2、你说的铺瓶密度越大越好，密度一般多少合适呢？如果铺瓶密度太大，还要考虑悬浮的细胞是否出现絮状物（应该就是你说的悬浮细胞层出现的细胞聚集吧？），这又如何处理呢？; @* e" B0 L, n
3、就像你说的，对于PBMC数量较少的情况，将PBMC全部用于CIK培养，那么后续培养是按照先加IFN-r，24h之后加anti-CD3抗体和IL-2？还是直接将三种因子同时添加？
- A' M6 ]0 I9 P: S, B' u4、当然，你说外周血方案进行DC培养不合适，我非常同意你的观点。

aochongyu

回复 lyj-0017 的帖子
) j0 f7 U, r% [7 Y% Z3 y
; v  X3 G  i: f  w, h6 h6 Z% f1 X个人认为那就是血浆中的一些蛋白析出后和细胞黏连在一块了，镜下观察就是絮状物边上带着很多细胞，像水母一样

lyj-0017

回复 aochongyu 的帖子
( _$ Q7 F6 a& X1 i% i% b, X& k% H# |$ [3 U. ?3 E
将这些絮状物吸走后，对初始细胞密度没影响吗？

momoenn

也得考虑初始接种细胞数吧？

weijunning

回复 lyj-0017 的帖子
! x$ P; V; j3 K8 P: i
! x+ B1 k  N! b9 Y4 x- l+ @* H1. 我们一般直接静脉抽取50ml外周血，这样得到的细胞量是非常少的，顶多2X107个PBMC。如果是使用采血仪进行外周血单个核细胞采集，那采集到的PBMC是很多的，一般是109个细胞。7 e" v) y, a% Z. V7 v) y7 i
2. 我说的铺瓶密度越大越好，只是针对我们直接静脉抽血外周血提出的PBMC。对于机器采集的PBMC，初始铺瓶2X106/ml.
- G  K+ e% t' w: L9 @% a( s3. 我们对直接静脉抽取的血样和机器采集的血样，进行细胞培养的SOP是不一样的，加因子顺序也是不同的。! t; O; f; J0 k1 P

lyj-0017

回复 weijunning 的帖子; Q0 g3 D0 G9 N; ^
1 e# j: m+ c. B, N4 x
如果是直接采集50ml外周血，按照分离得到2X10^7个PBMC，且铺瓶密度按照1.5-2X10^6/ml来算，初始培养基量也就是10多毫升的样子，按照这样的培养方式，培养一次最多能达到多少CIK细胞呢？

weijunning

回复 lyj-0017 的帖子. ~+ B% C: g' C3 b
5 W; O8 l8 Q6 g, b5 _- Y
你说的没错，我们初识铺的培养基也就10ml左右的样子，一般在瓶中培养3~4天，就会达到108，这时按照1X106/ml转袋，将细胞放入培养袋中进行培养。最后回输时，基本上单次都能达到109.: z5 f5 r1 X% t/ `% a# M3 `

lyj-0017

回复 weijunning 的帖子/ ^3 }: Z2 X) O* L* A. z. d( q
4 c9 s( y3 z+ @  M" Y9 N, S# t$ ]
你们的外周血方案是按照经典的那种培养方式，也就是D0加IFN-r，24小时候加CD3单抗和IL-2吗？