最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

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  t5 u+ m* |" I- L& |0 u; p9 Z% M& T( X" G6 ?& J' j$ N9 v3 W* C
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？
2 r! a2 W7 m! W4 R" [- j

cyberpig

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Andyhigh 发表于 2013-5-24 21:43 0 E+ u3 k4 x/ n2 c7 c
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: U5 b9 [' k; j7 z# I* g% o- D7 D2 h0 }1 ~9 v
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？

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! e1 {; ]7 s- g" j9 o6 A1 F5 J# k
我也是做IPTG induction。有些做出來了，有些做不了，要再試一下其他strain的competent cells。

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子1 h2 Y. G2 D9 {4 g
: i2 R( U& N# d4 ]
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

cyberpig

Andyhigh 发表于 2013-5-24 23:45 ) n! f! U( s, c
回复 cyberpig 的帖子8 M6 o; b( s2 F) n  W# C
1 v  F9 i6 v; r
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？ ...

$ Q. F+ h! l' n9 t
BL21, pLysS也有用~

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子' i. `7 r8 |4 O- Z1 }
( M2 a( Z. N' H7 p" x  H+ B
建议楼主; K' Z) \& l$ A8 [8 `
1、裂解液不要加太多，如果蛋白浓度很低，几乎是看不见条带的，于冰上（或4度）裂解，碧云天的裂解液我也用过，本身就是有点粘稠的。
2 H# J1 T. X# T- Q2、蛋白变性理论上100度10min，但我也试过只煮沸5min的，似乎也没啥问题，这里建议楼主检查一下loading buffer是不是有问题，我之前有一次杂不出条带就是因为loading buffer导致蛋白变性出了问题。
2 p8 d- J7 v" z1 j3、全蛋白做考染，个人感觉意义不大。
8 B0 e9 c) k, v3 D$ j4、关于转膜，marker能转过去，理论上蛋白也是可以转过去的。
3 [+ r+ Z9 w0 A! W- ?5、一抗的质量是做WB最重要的，楼主最好先确定抗体有没有问题，如果不是，那就是蛋白提取或变性出了问题。

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。  u3 E  `: ^. C: x! h

' B3 n4 J! o9 L3 |# k8 _可能失败原因：' R2 P, M5 ]: Y* l7 ^! W, [/ y; S
1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。
, Y! E4 R' N# `4 q8 ^2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序  " s$ z5 O5 F0 b/ u# r0 S3 E
' c- Y- Y8 V# ^; D
心得:
6 V# ^) ]) y5 s1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。9 [& ~' m$ X7 C& s1 F& T- F
2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题
& u! _$ j/ L3 g, P5 K; L3.做阳性对照
7 ]5 |7 r9 f3 O8 `7 j1 o1 x0 d4 _( n. g+ }4 |
在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···: h! @+ o7 V- [( C' A3 U
   
8 Q" |  f' V5 ?5 ~/ k! c0 T5 D$ \  

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子
) I: C- y6 g' [6 _) @+ ~1 S  {) i, x' _+ `
我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。# v3 D1 r3 s/ \
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子; Q$ [3 N# E# a5 F

' u4 f9 Z4 b/ A+ |& D# m我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。; o" ~) ?9 {' S2 G8 W9 ]6 U
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   . Y0 H) P+ {4 s- e5 ?( z
# v: u7 C" ]2 z, \3 o
还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？

cyberpig

回复 Andyhigh 的帖子$ A/ ?) Y3 J% [! _

) G& N; F1 G! L; B: ?0 b我做western時沒有做內參，因為我想表達的是帶gst tag的protein, 所以只用了已知gst +ve的樣品來做外參。而做sds page時，我則用了未誘導前的lysate做內參。

Andyhigh

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7 f5 t$ @) j( h6 B4 v* n2 L6 x! d0 \
我的试验目的和你差不多，我想表达的是带His tag 的protein，不过我想问下你回答中的"gst+ve的样品 " 是什么东东啊 ，ve代表你的蛋白质？
! h( d% D& V1 A. ?: ]7 O* G* \$ N# y; ^" V9 ^1 k
还想请教一个关于competent cells的问题，BL21 和 BL21 pLYsS 在后期细胞裂解上的主要区别是体现在是否表达溶菌酶上嘛？你是根据什么来选择这两种感受态的，最近在犹豫是否改用
8 q: U: z" V- }BL21 pLYsS 已方便后面的超声波裂解，自己手头有了 BL21 和 溶菌酶。期待您的回复