最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子  ~! E/ e% C# q2 C7 U' A
. l6 O# Z! p7 [( n, v- r; W# V
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？
, w* _( F7 M. H% R' i

cyberpig

# s% y7 n+ [4 M

Andyhigh 发表于 2013-5-24 21:43 ( l6 V5 ]4 r# A$ ?
回复 cyberpig 的帖子3 o0 C  B  l' X/ F$ Z
" M7 k$ C! d4 N$ Y! R, N& h9 M6 W
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？

5 C! D1 c* b9 K; J' W9 H/ p: P8 t/ k& f$ d& s) c8 ^( V
我也是做IPTG induction。有些做出來了，有些做不了，要再試一下其他strain的competent cells。

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子4 w% T3 F% a( j4 j. l

7 s/ _* A' X" \; D' o3 [- u那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

cyberpig

Andyhigh 发表于 2013-5-24 23:45 " _* s3 N' d1 P0 @  t# |# v1 `/ C
回复 cyberpig 的帖子
, M9 I+ L: ~9 ^9 X+ J3 L$ `* K: g6 C" j; h% \
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？ ...

0 [" Z8 |! w4 a* i+ u/ \BL21, pLysS也有用~

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子
8 [; }; E1 }! G( e* C) R$ |
3 o6 X7 y1 @  u2 v建议楼主# E4 A1 `) R$ c2 e
1、裂解液不要加太多，如果蛋白浓度很低，几乎是看不见条带的，于冰上（或4度）裂解，碧云天的裂解液我也用过，本身就是有点粘稠的。# G; b+ c* \+ I0 f- c* I7 x# x! ?1 n
2、蛋白变性理论上100度10min，但我也试过只煮沸5min的，似乎也没啥问题，这里建议楼主检查一下loading buffer是不是有问题，我之前有一次杂不出条带就是因为loading buffer导致蛋白变性出了问题。
* H8 Q( t! R8 w% z: X3、全蛋白做考染，个人感觉意义不大。
# `  J; {& g0 t# f6 w5 t' C* o7 ?& k4、关于转膜，marker能转过去，理论上蛋白也是可以转过去的。1 C( P/ x& ^! N9 P
5、一抗的质量是做WB最重要的，楼主最好先确定抗体有没有问题，如果不是，那就是蛋白提取或变性出了问题。

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。
6 k1 `( y4 P  }
1 H. n, q. d1 S# m5 W* Z2 y可能失败原因：# u8 d4 v" w7 P; J4 g
1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。
( K. v1 k5 g/ D$ Q2 a2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序  
, l9 e- ]5 B/ E+ S0 ?
6 o  f& ^1 K2 ~" G+ O心得:6 E( X  R5 L% ~! G6 @
1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。* g- e$ y3 x2 a1 p9 I# g- B6 l
2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题$ w/ c: B: x9 r- X2 T( N2 j) ~9 X
3.做阳性对照
/ q. g6 ?( @1 W3 }) \/ G8 _$ Z) z, l
在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···
9 ^; w0 `0 K0 O- Z" `; m3 V    % o" t' w+ H: ^' J. c+ |0 s
  

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子5 b7 A5 o4 @9 |; g
6 j; O; i$ y& b0 d" b5 ~2 \+ }
我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。" p4 Y+ q# n! P3 [. H
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子  z% ?) A  x  v" g6 R+ T) |

5 {% l  h; A  j/ C我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。
, T: Y, O& k" p* p8 p想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   5 t# `: B$ {# ]& h
( c3 P# |4 s; d( a% z3 u9 R$ `2 D
还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？

cyberpig

回复 Andyhigh 的帖子
% ?- Z( j- z6 m; U7 ~- t/ @; I- F) F- D6 L0 m+ H
我做western時沒有做內參，因為我想表達的是帶gst tag的protein, 所以只用了已知gst +ve的樣品來做外參。而做sds page時，我則用了未誘導前的lysate做內參。

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子
+ ~: a/ I/ J% W+ U" N4 |1 a" o' ^+ w7 \# j( W2 ^+ p
我的试验目的和你差不多，我想表达的是带His tag 的protein，不过我想问下你回答中的"gst+ve的样品 " 是什么东东啊 ，ve代表你的蛋白质？9 f, I2 `+ \  f5 s
6 d, i/ H. v8 u# |' O& H3 u: {
还想请教一个关于competent cells的问题，BL21 和 BL21 pLYsS 在后期细胞裂解上的主要区别是体现在是否表达溶菌酶上嘛？你是根据什么来选择这两种感受态的，最近在犹豫是否改用
+ Z, g7 i3 s$ |: e8 |$ \3 PBL21 pLYsS 已方便后面的超声波裂解，自己手头有了 BL21 和 溶菌酶。期待您的回复