最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子3 i. ?  D1 L0 \% c7 P

( C# ]/ Z9 ?. Y, u6 y好像做原核表达鉴定蛋白不用做内参吧，至少我没听说过，一般来讲做SDS-PAGE鉴定就可以了，严谨的话再做WB

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子) ~6 Z4 e) d  t+ Z7 ^5 D/ b
) H* d8 y) ?$ N2 C
哦 ，我就是想用原核系统表达并提取 纯化我的目的蛋白

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子
4 ~' p9 y1 f' ?- e/ p
. w/ N7 s( A1 ]恩，表达纯化，再做WB鉴定就可以了

cyberpig

GST +ve (positive) 指已知帶GST tag的protein (作western blot外參)。我想表達的東西同時有His和GST tag的。% i4 B7 H6 O- A3 M4 w, `

( n6 l- f6 z3 u2 M) C8 p- D# |' ~BL21和pLysS的分別應該只是有否表達溶菌酶，而我選這兩種是因為我們實驗室最常用這兩種。做IPTG誘導的話，它們的分別不大。但做autoinduction的話，pLysS不能用就是了。如果這兩種都不行，只能試一下rosetta, C41等。
3 b, ^: \' p. k( H3 k, p
! y5 \0 P1 a6 M3 q) t( `  o

hbs08230

在转入BL21以后需要做一次small scale的测试看看表达量。* W1 L- p, L4 R4 A8 s1 C$ ?% K
在涂了BL21的细菌板上挑5-10颗形状规则的克隆，用培养液摇床上过夜培养。第二天，每一颗克隆取10ul+10ml培养液，加上两个control，然后上摇床培养，直到OD值达到0.8，然后一个control不加IPTG做negative control，另一个和所有克隆一起加0.2M IPTG 做positive control。摇床4-6hrs让其充分。 所有培养液上离心机去除上清，留pellet。所有pellet各加1ml lysis buffer后vortex均匀，超声破碎3min，5s on and 5s off。一万转离心10min，收上清，收pellet。此时的pellet再加入1ml lysis buffer后vortex均匀。准备run gel。   |6 }7 D% p9 e& R- H; J
上清的上样量：20ul，pellet的上样量：5ul3 F9 C8 `9 a- D' r  Y4 a" r
加好loading buffer，95度10min。3 m4 s- \3 B% r- O" p: Y% t! ]4 ~4 x
只要你的marker跑好就基本无碍。
8 @% O( ]+ J! D0 J; |( ^考马斯亮蓝染色至少20min，脱色20min一次，共换3次后加多些脱色液通宵摇床上浸泡脱到无背景色。
6 ]" J" R7 F8 W; G  e) t有negative control做指标，在你想要的KDa位置上蛋白斑越大表达量越高。如果没有negative control做指标就不好说这个位置的蛋白斑是不是被IPTG
. T* Z1 y+ {' {) vinduce出来的了。
4 k! n" \9 t0 N' S! j如果上清中没有蛋白斑，但是pellet里有就说明超声破碎不够。

Andyhigh

回复 hbs08230 的帖子4 ?  {% C6 [* ?' V  O' Q

& A) b/ m( R8 u好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

Andyhigh

回复 hbs08230 的帖子
1 s2 g+ ]  U/ R8 G" S2 H( [, ^6 G0 X  X" |5 l! f
好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

fengjh100

, I+ A+ X8 S- V0 z  B; }9 n  o; Z
! i2 ?9 Z4 H' T3 A; m0 n
根据楼主情况，我觉得提取蛋白是关键，提取蛋白有些环节是不能忽视的，能保证在以下四点没有问题，基本上是可以使用的：1是在冰上进行；2是裂解充分；3是变性良好；4是定量准确。跑WB也有很多环节，各个环节都可能导致没有良好的条带出来，建议行点杂交实验摸索下。至于用丽春红 染色 ，个人感觉还是不怎么靠谱。所以建议：重提蛋白（最大可能是蛋白提取的不好）。至于电泳和电转，分子量不大的话可以低点的电压，电泳时用250毫安就应该够了。很多细节可以认为避免的应该注意。祝早日跑WB成功！

Andyhigh

回复 fengjh100 的帖子
- h* V: I; q# g5 V6 _9 v! V* E
5 b: y8 _2 V2 c. x9 n& {