DC-CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



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发表于 2013-8-1 01:58 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】
      CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。4 v8 E: T$ [/ P4 s9 q* i

      DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。8 i% H4 z! O5 Y. U
  ' h$ W' G' D/ m* o
      DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。7 Q1 y3 [9 i, {- E
  9 v5 X4 A- A7 E' _
【培养原理】
1．DC培养用细胞因子：
# X" L; F6 x5 F' ~- z$ A8 }- ^
•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：
            GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细5 l( m3 J" z( W$ Z9 `) F! d% z
      胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。- V. S% F8 x/ \$ ?

            GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，! F7 _7 M$ V8 u8 z1 d5 Q
      从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。3 Y5 T8 o+ ?0 K$ g" G) I3 M/ R
• IL-4 (白细胞介素-4)
               IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向
      分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能
      力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
  6 U5 K# o, a: C; u3 w
            GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取 $ T5 P. j+ z# \+ T! _" h; L1 l+ T
      和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不
      表达CD14。, H- y7 ]' B: L% w. ~4 v$ M4 H
• TNF-a(肿瘤坏死因子-a): I% y1 p1 R! ?. x  H" R9 a
               TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II
      compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟
      DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的- b( ~  O; B. Y* c. ~# c
      激活T细胞。

2．CIK培养用细胞因子和抗体：  • CD3激发型单抗：& X! K. @' G6 ^( C( d& S  S6 r
               T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈: t+ J: r) u* i5 ^4 B. P' Q. u
      的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表; q! {9 N% _3 ^- |* G/ R
      面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的  , s/ L& `5 m3 g# k: s2 _" L! K
      辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使- J) T8 ^, \" _! u
      CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸# X; m% I3 u" F" C
      (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇+ \0 @8 j) q2 l# R
      途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(3 Q0 ~2 V1 s& F  Q% y
      如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。

               由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子: `4 m" c4 U! @% P3 c+ f# M
      特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激. ?  R& F7 L8 e) q9 {+ Z
      活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，
      从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 " O+ j# d; L% v) Y

               此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺! Q7 W/ D( L+ I) {* H- u
         激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养
         时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
• IL-2 (白细胞介素-2)
               IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-" x1 k5 D/ t/ q" m" Z; l
         2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞
         活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加! J( b5 _+ |8 b4 ]. g8 i# h( `
         IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
• IFN-g(干扰素-g)
               IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强5 _1 m( I$ _3 X0 g
         度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活
         性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。$ f7 R$ p: V' N0 J
• IL-1-a (白细胞介素-1a) 　
               IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显
         提高CIK 的细胞毒作用。
  3 }3 w$ ^. h9 q7 N* q- K" d" O! u
【细胞制备】) X" h9 F2 q3 \% m/ r! N
1．外周血单个核细胞的采集
      1.1    用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
      1.2    淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
      1.3    无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。0 S$ f2 c6 y- g5 I. K) M4 [" k7 ^  D
) ?4 ]% R; M$ M
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
               用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-
      Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。

               用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，8 h- i! {3 n: M  r
      而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而) \2 Z3 f. L+ E! i: W
      实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
- v  G& u3 h% s6 H1 U. q: R+ G2 G
               肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或
      死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞9 d; S% y; F' I7 n( l) f
      裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
  9 K$ Q" c0 `3 G" |+ Z$ e4 t0 `
               反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：4 i7 S. p; R) t6 w+ p# ]9 U
      2.1    手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
      2.2    无菌生理盐水洗3次；1 C. ]' M  U/ q4 W
      2.3    用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；- z2 X! e9 c, Q
      2.4    200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；5 \4 Q2 U/ V3 P9 R
      2.5    用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；% L$ U) f4 T6 O2 L
      2.6    将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；
               注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。
      2.7    将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
      2.8    收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；/ b/ o  [, f6 U4 p) m8 f; n+ g- Y
      2.9    -80oC保存备用。/ ?) v) J9 ?; J  S& h

3． CIK细胞的培养及鉴定% v7 t; P) N- E; H* ?
      3.1    步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
      3.2    37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;+ v  i8 m/ Q0 @4 [3 b
      3.3    收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
      3.4    加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；/ E7 t7 |8 U8 S* d$ x
      3.5    24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；1 r* r) y$ a% ]3 v4 p& Y
                  注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
      3.6    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
      3.7    在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。6 @9 l1 m0 t8 B3 y! w2 j0 z7 ?
      3.8    CIK细胞质控：2 B: z9 s; D8 ~" r
               3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
               3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
                           显提高。& s6 K2 R0 H5 z

4． DC 细胞的培养及鉴定- F# I  p8 o9 I
         4.1    步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人2 D5 Z) j* A. |3 D6 _+ I9 R+ T3 Q
                  IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
         4.2    每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；7 c$ P0 z3 K5 G' A1 Z% x! A
         4.3    (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
                  注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。- `8 l- v+ a; {# }4 U6 H
         4.4    在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
         4.5    在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
         4.6    DC的质检：1 {$ B4 Z) M9 c  ~
               4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
               4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。

5.    DC-CIK细胞的制备和质检* P2 a6 H$ l2 K0 c# ?, _% E
         5.1    收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添% l; u$ r  q1 T
                  加重组人IL-2 (300 U/ml)；6 c: {0 X6 z7 z  r6 n, ]
         5.2    每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
         5.3    在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；) i( c/ a& ?+ w
         5.4    DC-CIK细胞的质检：9 }) S$ D; R3 g
                  5.4.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
                  5.4.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%
                                 以上。
                  5.4.3    细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
                                 细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 104
                                 个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检, s" j. d* n- d/ D5 L- y* u
                                 测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
                  5.4.4    收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病
                                 原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。

版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题）
  【步骤简图】

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