DC-CIK细胞的制备方法

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【背景】# ~9 T, V' E- S
        CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。! ^- Y! p# W: D4 I
  
/ M% ]6 J% N1 m- X8 `        DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
$ S* S' v" s2 O8 s  
. G8 w6 ]+ L( J+ H4 m6 v         DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
) F% w6 F* h* {  % m/ R: g0 `2 V1 J$ g8 o1 b; I
【培养原理】
) ?, M' u4 z% `# \3 K1．DC培养用细胞因子：$ U8 N# Z5 W/ b! z& g# N2 G/ z! W2 W

0 f* i" H6 w4 ?•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：" Q' Z* i1 r' B, v- E. p
                GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细% V% [7 m3 `" K8 J
         胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。3 E! y( u  D7 Q9 m% b
    \, L& x# r3 J: b
                GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，
' {) A4 R* i2 _) H+ {         从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
- A8 E8 P* i) F  @- o8 t: i•   IL-4 (白细胞介素-4)
9 T2 P/ r) f& B4 W! A# L( b                 IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向$ w, u0 p* _# r3 e5 W# c4 n7 S
         分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能
" k" v3 a; p% [3 Q# e         力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
1 g; [/ y; @. ]1 P; v5 C- T5 ~, o  
/ x% B  d! K8 M9 v% ]6 J                GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取 7 M: P% X& p/ {1 x: z; s+ I4 ~. L9 }8 q
         和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不
9 x7 D4 M- d4 P2 G0 ~: D$ s4 }         表达CD14。
+ X- i0 i" F9 ]! A0 `- \$ z3 U1 w•   TNF-a(肿瘤坏死因子-a); F. r, P: X4 v: U
                 TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II     
9 e/ z# Z" U/ p5 P5 r          compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟
/ y! I2 A# E: D          DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的
( e: Q% t: ~+ s8 V6 `# K          激活T细胞。
4 X& z5 {/ f! j( f+ X4 a0 P. D  ' k/ Z9 l1 b" a$ J# I1 o6 V
2．CIK培养用细胞因子和抗体：  •    CD3激发型单抗：
3 D3 M6 N' o8 F$ E2 J! f' j$ a                 T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈% R; f; F# q" [/ Z. s$ z
          的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表
! j& l" v9 y$ y- R) O+ s& \          面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的  
6 u8 `6 ~$ b( ?) Q; q          辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使
" O6 a, n$ \, G# L1 T5 v6 G* H          CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸
. J# C. Q- o+ N' l          (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇
" e8 Q5 Q5 d& f  p( p4 R9 g, f& v          途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(/ u0 I/ V, m' S3 q$ ?1 X6 x, A
          如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。! e3 j8 }; {7 i' E( l+ r
  , |+ x4 g% m6 o2 Y5 x$ D8 l
                 由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子
  X' F/ ?  p1 s" N* _2 |          特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激
# j1 {3 R% [* X/ V, w% E          活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，5 g$ f; C) I  ?3 h3 V: }
         从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
- ^, ~& ?5 V' ~1 `: \4 k, V          , T* D7 o9 T* @) {
                 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺
" ]) B; q/ Q5 W# _) H5 J           激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养2 ~8 _# m4 S( F. v/ q
           时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
1 M+ P6 I6 ]6 ?+ t5 N: S2 L9 o•   IL-2 (白细胞介素-2)
" R" h. x" Q- @                 IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-$ d: }2 Q/ W& G
           2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞  ~( H% G0 M- `. @# y$ ~
           活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加
# m* N' r. R4 n) V           IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
# h) n0 t% M* B3 W1 h# C•   IFN-g(干扰素-g)' R+ o3 |. T! f+ }* Z7 \# Q
                  IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强/ F/ P" {4 Z) U+ E" V. y0 O
           度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活
7 c2 Q# U! p4 }6 F8 P' h6 G           性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。  \& v' t# V6 t
•   IL-1-a (白细胞介素-1a) 　
$ |! `9 Z- N: @3 D+ A  z( C                 IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显9 S7 D9 X* H3 Z% y. q2 B
           提高CIK 的细胞毒作用。; o+ l/ h4 Y8 I+ X
  . Z9 Q* I. O) }# u% L/ q
【细胞制备】
& R9 d0 s" x, V1． 外周血单个核细胞的采集
& j2 H. ]' Q% n7 T        1.1      用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；: ]; o, G6 h) M/ L7 Z* n9 Z3 f9 q
        1.2      淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。  \6 z& P9 Z1 W% a2 \
        1.3      无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。
2 ]% e% e# ]9 P$ d   ' E. ^" g$ V2 `$ j% U
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
; |7 Z% M( }9 |& N                 用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-9 l; Y# |3 W2 R! D+ o8 o
         Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。, a/ n5 ~; j# X# h$ U
  
0 H+ D; N) A  g8 j                 用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，. P  A! O  m# M8 A9 T
         而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而
& s3 U- X6 o% E/ j. {% t$ z$ ~         实现对肿瘤细胞的有效杀伤。% R. o* {6 L$ m8 P, U  D
    : t5 g* Z& b( U' R, L+ U* y
                 肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或! P3 G. j0 g8 j' I1 Y: Y! F2 ~! }
         死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞4 k. E0 x, B, z( f5 s4 g
         裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。7 P# s, \1 x( A! G7 p( b
  $ M! m' F$ B# ~) }
                 反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：3 q" z3 B1 F/ ~- b) a( ]
          2.1      手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；- F5 \8 G6 r# a& z
          2.2      无菌生理盐水洗3次；  f: j# T4 O* z* x- N
          2.3      用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
* Z8 q; x6 N4 P$ B, R) z0 }7 R5 D          2.4      200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；5 ~" c' Z& ?0 _! C, a3 i; d
          2.5      用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
/ C- {& o$ [& Y5 n          2.6      将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；
& [: [. K6 i  `# |5 A% n! ^                   注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。: r) Y" v! k* F) }5 b7 f
          2.7      将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
$ _. ?; }* i# H% s9 Q2 G! N# X          2.8      收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
4 J0 P$ K, e9 q) m/ u5 X( ?$ B          2.9      -80oC保存备用。+ |( m% Z, v% h
0 V! L" m9 ]1 h( F( Y9 ~, e1 S. s
3． CIK细胞的培养及鉴定
: K8 t. V) J9 |- g) W          3.1      步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
- S/ A: `) g; @7 o, `$ l          3.2      37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;
; f. e8 m3 }! w          3.3      收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；' e9 ?* k- X5 H: |
          3.4      加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；4 J2 C3 d0 C) X1 K: t0 Z/ m
          3.5      24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；; p- z* J1 \3 q+ g
                     注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
! Q. M) l5 n" \' I. C! Q          3.6      每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
; F+ I! L+ q0 H# ~          3.7      在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
0 T5 S: x0 E+ b$ L          3.8      CIK细胞质控：- u. D7 k) i; N/ c+ N6 Y+ p4 q% y
                   3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
& Q4 r+ Y: U& e% ]+ e2 c                   3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
* u  L3 v4 j' x  g                              显提高。3 |. w9 O9 R# N" _/ c' M
  
. G* C. x: C7 @/ w 4． DC 细胞的培养及鉴定
7 w+ r  K( m/ ]           4.1      步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人
! l5 b0 O* W* Q! {9 q, ^1 v3 j                      IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
5 ?- ~+ h6 i7 |8 q) m' @           4.2      每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；  x; c" d# a0 Q6 n" m$ a
           4.3      (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
$ `: J: c: a% s8 ?' N$ B                      注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。% \7 p9 b9 o8 ^  l$ a3 E# n' y
           4.4      在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
" w) L' z' h) H1 d           4.5      在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；+ z4 w, d8 V# u0 m- h7 S. ]
           4.6      DC的质检：
7 q$ r8 a& S$ T1 g: l6 U$ ^- o                   4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
" A" `! u2 h  Q" ^# |1 H                   4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。
) d# s! R  Y" w3 w- k  ( l# D0 i" U4 ^. J8 r: \
5.     DC-CIK细胞的制备和质检
- }+ t" w% {4 r& Y6 V           5.1      收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
: U  F# M  t$ X( k- p9 V                      加重组人IL-2 (300 U/ml)；
4 L- A  ?7 ]" i$ I6 n. {- k           5.2      每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
. [8 K4 W. Y$ O# r* L% x6 l: `           5.3      在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
& Q6 r) {7 O0 R5 T. p8 W           5.4      DC-CIK细胞的质检：# E. n) A. a( }7 {3 p, c
                    5.4.1      台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
& @4 m4 {6 ?3 f- k& x5 b1 h                    5.4.2      流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%
8 ~! U7 q! ?) E7 z% F                                   以上。; b0 A# B' }( v. h0 o' W
                    5.4.3      细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
$ l) w  |) w9 m                                   细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 104" P3 h' z, ^# k5 h) {
                                   个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检4 y# M: W& u% {: S+ _
                                   测效应细胞对靶细胞的杀伤率。$ W  w% `8 W0 l0 m  p$ Z
                    5.4.4      收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病) Z  H; n% _: L
                                   原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
. \+ d; n/ G: ^8 @4 Z0 c7 i4 j/ a' `8 l
版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题） 5 N0 j! E! w. J6 f3 c' g2 N" k7 F
  【步骤简图】
, e( F; {! s1 }$ a! \1 m, d% `. l2 Y: N) ?( }0 k& G

yakunsong

学习了，非常感谢

mmssyyee

很详细。

aidiulgy9517

回复 defu 的帖子
# T( u. u% r/ z; V  j* V: v& \' A! i! K) V9 w) `
很好，谢谢！ 不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。

Life_Tech

支持，很好的内容。

刘艳85

想问一下，CD3用的是什么厂家啊？谢谢

细胞海洋

回复 aidiulgy9517 的帖子
. N% w9 ?; H: n& C% f
1 F& _! k7 f: d& q4 e9 |你好 这个问题我不懂 因是会员发布帖子 尚需大家来共同确认是否存在错误。
; `2 ?( O! Z# X$ d & q, Y* e: R) C2 S8 u/ t
帖内已经红字加注，你能说明一下具体哪里有问题，如何修改？; ~1 X/ ~& E, `3 v; {
0 O0 @. R* z# i8 [  x2 X5 F# ?4 }
谢谢你的支持

helong

DC的培养方法已经发展变化了，上述方法算是经典方法，但耗钱费力。' E; z/ x2 ]& `- [. w$ o* b
CIK是非特异的方法，DC具有一定的特异性，DC-CIK联合则兼具特异与非特异，实际情况是不伦不类。/ z+ k3 S, [0 P+ a* h" i2 u' }
实际应用中，我相信CIK+DC方法优于DC-CIK！

aochongyu

很好的帖子，顶一下

helong

回复 细胞海洋 的帖子* T( ?' u1 Z' X2 J# Q# H, H. k  P, f- E
- s: W+ O& p" j$ _
看来斑竹也是大外行