转染率问题

lmh_yixue

我们请公司包装了慢病毒做A细胞的转染，发现第5天就出现了克隆样细胞，目前第11天，克隆已经很大了，想知道如何计算一下这种细胞的转染率是多少？是否有意义？比如我们转染了4*105个细胞，以1:10转染，最后获得的iPS细胞微2*105个，那么转染率是否是50%？还是用绿色荧光蛋白来算呢？
8 F2 ?& l: k  g* h  v- E0 o; a1 k- u谢谢！

limeiying

1:10具体指什么呢？转染前细胞数量：（病毒滴度×病毒体积）=1：10？

lmh_yixue

回复 limeiying 的帖子
9 q! M/ l5 \1 t5 w5 G# }
' H3 H; a% b; q) i2 hMOI值，即细胞数目：病毒数目=1:10

sun_happone

应该是用绿荧光蛋白来算，可以通过流式检测，以没有经过慢病毒转染的细胞作为阴性对照。

neuralstem

回复 lmh_yixue 的帖子8 k, j0 }  d# {! ?& V3 h: o: _
0 o7 w0 f6 q8 I# a% z
No....转染细胞过程中， 有细胞死亡， 也有细胞繁殖， 所以不能简单的用positive cell number/beginning cell number来算转染率。
. K6 O' b2 w7 l7 [0 B/ |
7 }1 B' }1 q4 u( B/ D9 l正确的方法应该是看转染也后有多少百分比的细胞表达报告基因（GFP). 方法用flow cytometry。 如果细胞不能trypsinize的话，就需要在confocal microscopy然后镜下数细胞了。
' ?; X( t# u5 [" @. B% |
0 u* ?" y+ _. o, e6 k如果直接看看不到的话， 建议用抗体染一下。 3 F, ~8 ]$ s. L; j# _

neuralstem

* t1 z: K$ _" {$ B
* K+ j: V. ~/ R+ g
回复 sun_happone 的帖子
" f5 U% q1 S- @& }% M+ d5 S
/ K4 P1 f$ B8 R. T用未转染的细胞做对照是不对的。 lentivirus有毒性。 未接触lentivirus的细胞当然状态好， 数量多。
; z7 ^% Q1 ~4 ^  o. H
$ m9 h, _+ }7 B. b# {/ k. w正确的方法应该是用control lentivirus（比如空载体）做对照。 不过我觉得不用， 直接用lenti-GFP转， 然后看有百分之多少的细胞表达GFP就可以了。

sun_happone

回复 neuralstem 的帖子
0 |9 ?: z, O0 P
% g& z3 x7 M3 u& ]  Q7 E- Wo ,谢谢，学习了