ddPCR技术助力定量miRNA

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ddPCR技术助力定量miRNA
* N2 U4 ^5 D. z# a! R( Z2013-09-02 来源：ebiotrade 作者：koo
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# ~  a6 ~# m# J3 k$ I1 E' c! F日前，来自伯乐实验室（Bio-Rad Laboratories）与弗雷德•哈金森癌症研究中（Fred Hutchinson Cancer Research Center）的研究人员证明液滴数字PCR（ Droplet Digital PCR，ddPCR）技术能在不同情况下，可被用于准确，可重复性的血浆和血清 microRNA（miRNA）量化检测。这将为 miRNA 及其它核酸用于循环生物标志物的应用铺垫了道路。" e& A7 |1 t3 ]& u" A# E) n
相关研究论文刊登在了近期出版的《自然-方法》杂志上。研究人员表示，在循环系统 miRNA 诊断领域，液滴数字PCR（ddPCR）能助力生物标记物研究，直接比较同一实验室跨天多次试验，甚至不同实验室之间的检测结果。
) Q( T! F5 }& H* f. gmiRNA 定量研究的挑战
8 V& w0 q( Y2 e4 l$ rmiRNAs 是一种小分子调控 RNA，具有许多不同的细胞功能。人类基因组编码超过 1,000 个 miRNA，这些小分子可以靶向哺乳动物基因中大约 60% 的基因。由于 miRNAs 在许多细胞类型中都富集，而且高度稳定，因此它们也许能为我们提供有关疾病进程的一些直接信息，也正是由于这个原因，不少实验室正在积极展开癌症和其它疾病中 miRNA 血液生物标志物的研究。
: V2 I0 f$ M/ _: Y0 m+ G实时定量 PCR（qPCR）已被广泛用于血液样品 miRNA 的分析测试中。但是研究人员发现，血清或血浆中的 miRNA qPCR 测量出现了极高的差异性，无法用作稳定的血液生物标志物的检测标准，因此这一领域的研究人员一直在寻求一种能获得更可靠结果的新方法。
) o! j0 S6 ]1 u% s利用 ddPCR 技术进行 miRNA 检测的优势9 B& ^2 r5 b0 F3 b
数字 PCR 具有许多优于定量PCR的优点，比如无需标准曲线，以及不受不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，就能获得绝对定量。而这些优点都体现在了 Bio-Rad 公司推出的这款 QX100™ Droplet Digital PCR （ddPCR™） 系统中。
- |) @# U  b8 E9 T! |7 B这一系统于 2011 年推出，不仅实现极高的检测灵敏度，而且还避免了使用患者特异的 PCR 引物所带来的扩增效率差异。
. W1 ]- a! W1 j8 w' {9 Z研究人员表示，他们选择使用Bio-Rad公司的 QX100 液滴数字 PCR 系统，因为它是目前市场上的第一个从成本和通量上考虑，适合于实验室日常研究的数字PCR系统。* c$ `; L1 G" g( A$ j% l* W. A- n) z& v
为了评估每个工作流程的步骤，包括连续稀释准备，反转录（RT）和PCR扩增，研究人员分别在三个独立工作日中，通过 ddPCR 嵌套分析对比定量 PCR，对水和血浆中 6 种不同的合成 miRNA 各稀释系列的cDNA进行分析，结果发现比较于 qPCR，ddPCR 在 PCR 特异性变化方面，具有更高的精确度（48-72% 的更少变异系数）。! y9 B& J9 i* S& m) n8 h) ]7 Q
接下来，研究小组进行血清 miRNA 的 qPCR 和 ddPCR 并列比较检测。他们收集了 20 例晚期前列腺癌患者，和20例年龄相匹配的男性对照血清样品，分析其中的 miR-141 丰度，miR-141 是一种已被证明的晚期前列腺癌的生物标志物。
) S1 s# q" W# x2 a7 B4 a研究人员分别在不同的三天里准备了 qPCR 和 ddPCR 分析的不同稀释浓度，并进行了检测，结果发现 ddPCR 相比于 qPCR，能提高7倍不同一天里实验室的重复率，这在对照研究中也得到了证实：ddPC R的结果更为可信（p=0.0036 vs. p=0.1199）。. c2 _; q; W) b+ d1 L& t2 A
研究人员指出，液滴数字 PCR 将能帮助他们更加精确的追踪病人治疗期间不同时间段中的血清 microRNA 生物标志物浓度变化情况，这对于实时 PCR 来说，有时是不可能实现的。
  J' M2 ?& z8 e! @: x原文检索：
! j9 o, M% m* zChristopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella, Muneesh Tewari. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods, 01 September 2013; DOI: 10.1038/nmeth.26332 S3 ~5 Y7 A, w' W5 Q" K

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