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引物设计是否正确 [复制链接]

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楼主
发表于 2013-10-9 16:00 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 小兔子lp 于 2013-10-9 16:04 编辑 , }0 c, {( |3 u: k; O: O8 K

7 {2 h# s! k( O! x- f提取了RNA,反转后想扩增Pdx1基因,之后连接到病毒表达载体包装病毒。pdx1的CDS序列如下:5’-ATGAACAGTG……ACCCCGGTGA-3’。: A( d  Q" T7 g$ K! r
上游引物直接设计为:5’-ATGAACAGTG]-3’
7 M; t8 y. Z+ l% x0 t& |下游引物直接设计为:5’-[TCACCGGGGT-3’(ACCCCGGTGA的反向互补序列)
0 E1 n6 H8 ~. |! `' W  ^请教各位,这样就可以了吗?这样设计就用不到PP5软件了呀!
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沙发
发表于 2013-10-9 16:52 |只看该作者
Tm值和加了酶切位点后的Loop Tm值都要用软件看下多少啊,上下游Tm值差异最好不要查过5度,loop Tm值最好不要超过40
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藤椅
发表于 2013-10-11 14:58 |只看该作者
本帖最后由 小兔子lp 于 2013-10-11 14:59 编辑
$ r4 ~; A- z* p  G. G& z: ^3 A" w: `( f0 I# v6 N2 Z3 P1 Y
回复 murong 的帖子
( C5 J% b  V) n; y# L
1 P& {7 I" w2 x3 C验证引物是否可用是确实用了软件,可是在设计引物时就用不到软件了呀~我将CDS区复制进PP5,软件设计出的引物和我手动设计的这个也不一样啊,这是怎么回事呢?望指教
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板凳
发表于 2013-10-12 14:53 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
回复 小兔子lp 的帖子0 R/ A+ p( B) E7 e3 |$ G

$ E! `, K' [1 _: P8 q: l7 v妹子呀!设计引物重点不是看你能否将设计的引物正好配对上去,重点是要看如下几点:
3 U5 {2 y5 g) g# h# t(1)希望将自己的PCR产物连入载体中,是不是要解决酶切位点的问题。如果不用软件,随便弄两个酶试一下,万一他们的识别位点在你的基因序列之内,怎么办?那不就切烂了吗!
& a! L, A6 F8 g# \0 B(2)不用软解分析,假如使用的酶在序列中没有酶切位点(走大运了!),但是保护碱基添加的数量或者酶切位点序列的添加不对,造成移码突变,等你连到慢病毒载体上,就是不表达蛋白,那就洗洗睡吧!
5 O: x1 p/ E  o* U# T& S* x(3)万一自己的实验需要某种标签,来指示自己蛋白的成功表达,可惜妹子没有在意基因序列之后标签蛋白的感受,自己弄一个就可以了,如果造成后面蛋白移码突变,标记就在也不想理你了!所以要学会使用它呀!可以多问问你的师兄师姐。
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