引物设计是否正确

小兔子lp

1 Y2 O- ]4 Z* ?+ [5 K8 C. m: T4 z( G/ }. Q% {& k  b& ?+ N: I
提取了RNA，反转后想扩增Pdx1基因，之后连接到病毒表达载体包装病毒。pdx1的CDS序列如下：5’-ATGAACAGTG……ACCCCGGTGA-3’。
  T& ?) i3 m$ h2 C5 f上游引物直接设计为：5’-ATGAACAGTG]-3’/ T3 q6 `: r* p( L( K
下游引物直接设计为：5’-[TCACCGGGGT-3’(ACCCCGGTGA的反向互补序列)
% u9 Q& g; W6 D0 m; O% c+ ~, H请教各位，这样就可以了吗？这样设计就用不到PP5软件了呀！

murong

Tm值和加了酶切位点后的Loop Tm值都要用软件看下多少啊，上下游Tm值差异最好不要查过5度，loop Tm值最好不要超过40

小兔子lp

0 }/ w" z- V& t. y2 j) n

* ~, |: K+ O* D% e, g& h回复 murong 的帖子  P6 H1 |' G. |" d5 A; u

* D+ U$ G0 `: ~+ r( Q3 Z& F* u5 E验证引物是否可用是确实用了软件，可是在设计引物时就用不到软件了呀~我将CDS区复制进PP5,软件设计出的引物和我手动设计的这个也不一样啊，这是怎么回事呢？望指教

biovictor

回复 小兔子lp 的帖子
: F; W- p: U0 f3 Y" k1 ~5 M- f* A/ o1 b
妹子呀！设计引物重点不是看你能否将设计的引物正好配对上去，重点是要看如下几点：
3 I) _& @' b0 y8 a（1）希望将自己的PCR产物连入载体中，是不是要解决酶切位点的问题。如果不用软件，随便弄两个酶试一下，万一他们的识别位点在你的基因序列之内，怎么办？那不就切烂了吗！1 y0 R8 |  I: ~7 ]
（2）不用软解分析，假如使用的酶在序列中没有酶切位点（走大运了！），但是保护碱基添加的数量或者酶切位点序列的添加不对，造成移码突变，等你连到慢病毒载体上，就是不表达蛋白，那就洗洗睡吧！
- [5 r! N+ k- S9 }0 ?. Y! v- y; T（3）万一自己的实验需要某种标签，来指示自己蛋白的成功表达，可惜妹子没有在意基因序列之后标签蛋白的感受，自己弄一个就可以了，如果造成后面蛋白移码突变，标记就在也不想理你了！所以要学会使用它呀！可以多问问你的师兄师姐。