引物设计是否正确

小兔子lp

( X4 w- Z; O2 \( N4 h5 {8 U! |, V9 x- E7 d, f) k
提取了RNA，反转后想扩增Pdx1基因，之后连接到病毒表达载体包装病毒。pdx1的CDS序列如下：5’-ATGAACAGTG……ACCCCGGTGA-3’。3 j0 F, o" k% n
上游引物直接设计为：5’-ATGAACAGTG]-3’
" P( v$ Q. J: |! o* ~% v6 P! n下游引物直接设计为：5’-[TCACCGGGGT-3’(ACCCCGGTGA的反向互补序列)
- s* y, H3 G# x; Q# ?. r请教各位，这样就可以了吗？这样设计就用不到PP5软件了呀！

murong

Tm值和加了酶切位点后的Loop Tm值都要用软件看下多少啊，上下游Tm值差异最好不要查过5度，loop Tm值最好不要超过40

小兔子lp

, m1 G* m' `% s/ A8 y8 Q/ N
+ f8 @4 B  R5 n9 h
回复 murong 的帖子
+ ^: ~5 }: V9 E$ n8 Q
2 U$ O. ^3 X$ T8 C. O3 v4 n! ^; N0 f验证引物是否可用是确实用了软件，可是在设计引物时就用不到软件了呀~我将CDS区复制进PP5,软件设计出的引物和我手动设计的这个也不一样啊，这是怎么回事呢？望指教

biovictor

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' I1 j/ w2 s. I" y  s
妹子呀！设计引物重点不是看你能否将设计的引物正好配对上去，重点是要看如下几点：
. p9 {2 E  q- O; C" y+ W" K（1）希望将自己的PCR产物连入载体中，是不是要解决酶切位点的问题。如果不用软件，随便弄两个酶试一下，万一他们的识别位点在你的基因序列之内，怎么办？那不就切烂了吗！
. P+ |7 `6 y6 k+ h7 \) D（2）不用软解分析，假如使用的酶在序列中没有酶切位点（走大运了！），但是保护碱基添加的数量或者酶切位点序列的添加不对，造成移码突变，等你连到慢病毒载体上，就是不表达蛋白，那就洗洗睡吧！
# r6 L- N/ z- ]0 v' ^: d（3）万一自己的实验需要某种标签，来指示自己蛋白的成功表达，可惜妹子没有在意基因序列之后标签蛋白的感受，自己弄一个就可以了，如果造成后面蛋白移码突变，标记就在也不想理你了！所以要学会使用它呀！可以多问问你的师兄师姐。