求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

我们做过猪，相对比小鼠的要难一些

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

2013sp

回复 小咪咪 的帖子) y* C8 p# M$ N% w) q/ L3 o) S
" u( s. R4 {- v, s1 p
能提供详细的注意事项吗？
# N8 y1 b! P6 A. ^/ L2 W/ D

490096812

给你个流程吧：
. l, a( w7 w% A5 o( f; W# s1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。! M  I# B' P; D
2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。  I( J" X- w: W$ e6 T/ M. r
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。' R3 q& O. X: g9 u
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。, Z! y( v+ X5 Z" M+ H( h
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。& a- g) Y1 W) K9 v7 D
6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。+ Q5 x3 t: w. G3 ^" w9 ~% `: j& p& h6 m
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。
1 Y% z# [9 v9 @4 V8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。
9 v! t! E' g9 e6 v: F5 s6 g9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。6 h9 o& @# Y+ y+ u. T9 r
10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。1 A) [% h& U3 U' `, t7 B: A, [. z
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。* K2 c! @4 N" K/ s  {7 S. Q
12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。8 X" J. `2 Y+ h4 h" P: s* _
13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。
+ s8 |0 I0 `2 a) O2 m5 W8 k14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
5 [7 O% y( P+ t6 K& d+ {" g4 [15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。1 N/ z* e' l( W- p

小咪咪

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/ t3 S7 G% ^( C) h0 X8 s+ Y( A! V  p! J
详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。/ R6 `/ ?+ O- @0 S
注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。
8 t% w9 w, z, y/ T0 t6 x1 p                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。8 K: ]1 l2 L! P1 Z/ t
                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。
4 Z; B' ]" X3 j6 y) v

w343989328

回复 490096812 的帖子+ ]3 _3 ]4 Y) e* g: p
* T  ], m  v3 D" m
你们取的是多少天的猪的睾丸

490096812

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9 v% G6 b: R& R, X. Z. w9 m4 H
; C3 b9 h8 h+ ^越小的越好吧

w343989328

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) y" r  [* e0 ]. t4 T: O- g& J3 W% J, k
刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧