求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

我们做过猪，相对比小鼠的要难一些

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

2013sp

回复 小咪咪 的帖子# J" S  a! q% {8 n9 ^, }8 m
5 A7 w" T6 Z7 Q$ l
能提供详细的注意事项吗？, L5 ?9 r1 ~: q

490096812

给你个流程吧：6 L4 l5 G  d: w0 Y
1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。4 K7 ]! ^& L  u" U3 T
2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。9 P3 {: g6 P) m5 J! A2 [
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。- t. @  l6 z' v+ N( L
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。
5 w" a  u: W! ^: H8 V0 q5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。
2 ]8 U  I" M+ e) i5 h: e! C0 s6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。
6 _+ |4 i5 z, E- [$ T, s" l7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。$ o! z, _7 ]2 |- S
8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。/ a( R! T8 P/ H" @1 @! I
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
! l+ O  a1 F3 f% F. o; E# N" ]10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。) h% ~. {+ k+ O+ m. V1 ?
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。
( `- U$ d$ b4 n* L. }) }12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。2 J6 V# d( w3 c* h% i
13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。. |" g4 Y: v/ j5 {& k& \
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
, }) Z; ~  l9 u15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。6 g5 R6 E- m. a" b( s

小咪咪

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% p4 ~# n2 O! I4 G. l0 r8 K. W8 P# C  s* q
详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。
! G1 y* z0 L+ g, N! H2 g注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。
$ q. r: L9 d3 r# p- ?' W                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。, s* a" Z. Y# g% a1 u
                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。5 Y3 x( W1 K5 }! v) d  p: w

w343989328

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# Z8 ^4 T3 Z! z. T$ u
, o( b9 @8 W; O: _9 F6 k" D/ \你们取的是多少天的猪的睾丸

490096812

回复 w343989328 的帖子4 N6 c- F- |$ O* c1 }$ A& L

% K6 C! o% h* R( O越小的越好吧

w343989328

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* |+ n% }3 c. ?1 E( {3 _& x/ p  D$ G  P" N  Y3 n1 j
刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧