求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

我们做过猪，相对比小鼠的要难一些

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

2013sp

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( J9 X/ Q* {. e) p) d
能提供详细的注意事项吗？
+ E' o, g% Y2 u" a+ f$ Y( Z+ t

490096812

给你个流程吧：9 h% ?- c- J; I
1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
( @2 C9 u( z! h+ t  e! T2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。% S# g9 C! C& d. L  O6 a) y+ w" R% C
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。' f) k. j: M* h2 U
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。+ K0 R% `! |4 _
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。
  V! u# Y+ G7 d; T* G( y6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。
9 v( p7 `0 ?2 V) d) K: h* @8 }7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。4 ~* ]- Q$ L  Y8 \2 N
8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。* w2 L$ |" p  S6 }8 c+ T
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。3 |7 w/ U" M% f3 a5 E
10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。
" C4 F# w# n: }& l' K11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。
! i. e' r$ [2 J12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。: l7 s8 @4 W. i" Z
13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。
* f9 y" [# z3 ?: r/ E. i8 h14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
5 a. p. j" Q2 B! u2 z3 y* M# r15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。
6 P. @+ K( o1 W) t" C

小咪咪

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9 `- ~5 h' t1 O8 d! F; X详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。
/ z* a2 F- e  t注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。
8 {) F3 |6 }- }                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。7 R5 P& u2 c/ b' R( Q
                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。: V! T9 q' D. K3 y- _0 k

w343989328

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7 _" H* q3 }3 K' C7 a* z
你们取的是多少天的猪的睾丸

490096812

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: }  h5 d! I* {1 g. W' m0 v4 Y5 Z5 b6 D1 A( [% e0 E. `( }
越小的越好吧

w343989328

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$ Q/ u+ L+ d+ r
. z$ q- g; c- s/ s/ n- U刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧