求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

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$ a8 _6 Y+ T8 f3 L8 D% `2 [2 K( L9 l4 y, ~
的确是，这也是研究的一个瓶颈。但是采大猪的样不好采啊，人家都在7d以内就阉割了

w343989328

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. i9 `% C" o: m  U$ }! H( N
- S: E- a' f8 A" w1 v8 W# k$ R刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧

490096812

回复 w343989328 的帖子5 ]# o/ V+ v; x- R- L6 Y3 y* d  K

9 x$ V1 E( U& H/ N1 _) v! y5 k越小的越好吧

w343989328

回复 490096812 的帖子* J) G# o; h0 ?& Z- P+ M' a

1 A2 _3 M; u* ]" c0 T! ?你们取的是多少天的猪的睾丸

小咪咪

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2 V) |% R5 H. ^) Y& I2 t5 x5 y3 V$ T8 x2 b( y# F' {
详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。
8 S/ T. f$ {1 X( K7 ]; {4 _3 y注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。
% a9 P" n+ P/ v  i+ P' |                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。
( w" M3 v, ~$ C! Q' [( e0 w                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。) i9 Z7 R  b+ ?  k& O- B' w

490096812

给你个流程吧：
) n7 D0 O+ B) m+ s  p1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
5 U3 c& [( R2 X( [2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。
# S  r( k' w! z8 }; x* }3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。
1 A8 T7 d( r8 W1 d# ~% I4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。  K; _( j" [5 A  n/ a3 D- \
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。, Z2 j3 B# n" ?1 Y$ f( D
6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。3 d6 N5 q! p3 |3 z
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。
# x& z; k8 R, r% A; M" Z8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。; o( [0 S- z9 u: ^( m
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
; C0 u, U9 Q  s6 N10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。5 Z- c8 S( c" ~9 m* L" b% l3 }
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。' |% Z5 k7 J3 `% i# d$ \
12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
2 _  [/ c* {) d13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。
" G- y9 Y7 W4 I) N- M2 _8 ]7 \14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
% A, m+ g. Z5 C3 Z- g& w! ~15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。
. g% C4 |5 _/ t" |

2013sp

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! ]! [' }& s! B% c" b- k0 T* L+ x, Y6 H; d# V& i* \& ^
能提供详细的注意事项吗？* U' j" H2 |  q( S- W

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。