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求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。
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作者:
2013sp
时间:
2013-10-11 10:24
标题:
求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。
求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。
作者:
490096812
时间:
2013-10-11 10:53
我们做过猪，相对比小鼠的要难一些
作者:
biovictor
时间:
2013-10-12 14:58
我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了
。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。
作者:
小咪咪
时间:
2013-10-13 21:28
简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~
作者:
2013sp
时间:
2013-10-14 10:20
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小咪咪
的帖子
4 o i6 B8 e$ K# g5 @9 A
# f. A9 F; O; W0 U \
能提供详细的注意事项吗？
! u' S7 G- O: a+ L3 K
作者:
490096812
时间:
2013-10-14 13:47
给你个流程吧：
$ y5 {* N9 F/ ~' I! D/ {& A5 u& y
1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
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2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。
2 |* }4 C! W# }* d% ^3 u U* i
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。
6 V2 [' v: U( v* o
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。
' K5 k8 E, n7 n x' P1 P% y. Y2 Q
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。
* r1 p. z* t. n5 F/ l# H
6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。
9 g& ~4 X) Z4 F
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。
4 X* l' a5 C& d/ c$ }* a
8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。
5 q! w8 z9 n- l; e2 d1 U3 {
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
& w0 u3 E/ C( G: v* P Z2 h
10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。
$ Y9 |; ~5 ]# |: k% O! g; F
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。
1 w/ Y! F4 I1 T' G" F
12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
5 p- x9 R% y; F/ t
13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。
1 R2 F: i( B! e
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
6 k( S B8 i& w9 |7 d5 k6 w
15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。
+ k* v9 ~3 l/ I$ S
作者:
小咪咪
时间:
2013-10-15 10:52
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2013sp
的帖子
1 {3 H/ b8 l4 q1 L/ L! @
/ t1 X# E. k; h- X% O
详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。
* I( l/ q( \/ Q. r2 _3 T
注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。
7 M; x) N }) `4 h3 S
2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。
) Q$ l' C( M/ A: z& Y2 e2 X
3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。
" {0 ]6 A7 t& W
作者:
w343989328
时间:
2013-10-15 22:40
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490096812
的帖子
. @4 f V2 K: |
* {7 z: Q! K2 k3 t' v: q
你们取的是多少天的猪的睾丸
作者:
490096812
时间:
2013-10-16 11:58
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w343989328
的帖子
8 q" F7 K5 Y9 b% C' v3 @
7 T' `* o, j( e1 b- V# P1 d0 `6 K( n
越小的越好吧
作者:
w343989328
时间:
2013-10-16 13:19
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490096812
的帖子
- q) u3 g. b8 [
3 w/ {) C* r6 |' ^: z
刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧
作者:
490096812
时间:
2013-10-16 17:37
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w343989328
的帖子
9 y3 |) g: F! v! c }
6 M1 F& p' m5 C# i0 |' m, p3 A+ Q
的确是，这也是研究的一个瓶颈。但是采大猪的样不好采啊，人家都在7d以内就阉割了
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。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。