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给你个流程吧：& b5 h+ j8 m5 X2 g! O7 [1 L/ x
1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。& A- y9 |' b1 U, Q- H3 z
2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。2 J# y1 C( } p: ~- a% X) v
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。4 p# d0 h) I1 Z% U; z
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。8 g7 }5 R, O0 r+ J+ p
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。/ H. A1 z) z5 k( c6 m# L
6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。! w& k) l- j$ J( K
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。/ X5 x6 ^! Z& m. p& R+ K- E7 I
8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。7 z$ g5 H+ B$ S d% ?8 C0 H
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
$ ^2 k. f; K3 S* T10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。& W7 |" E* ^, O2 l& F2 C N
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。
6 \* f7 h/ O' L+ u12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
5 P* L/ b$ Y3 P8 q2 l0 i O3 T0 s13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。% ~7 o" H4 A; z8 i& u! N7 w. z
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
' F, {: H ^3 A: Z: ~15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。" K" _7 A" S' s- x
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发表于 2013-10-11 10:24
。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。