消化MSCs时候用胰蛋白酶+EDTA,事后必须离心吗？

阳光无畏

看了一下相关帖子。总体认为消化时用胰蛋白酶和EDTA一起效果会更好。# @/ j) ~. u* ?( F  d2 m7 T' a. z
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原因如下：胰酶对蛋白质有水解作用主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键！使细胞间质中的蛋白质水解使细胞分开！EDTA能与细胞上的钙镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。9 r1 ~$ d, }7 t. ?
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但开始有人担心：EDTA对细胞有损害作用，是否要加呢？% n0 j7 Z. B. R# x5 ]( H3 U& m
于是开始有人解答这个问题：EDTA存在的时间短、浓度低，而且事后用完全培养基冲洗稀释，一般不会造成细胞损害。更有人提出，可以通过事后离心的方法，把剩下的EDTA去掉，这样就不怕它的毒害作用啦！可是，又有人疑问了：离心对细胞也是有损害的啊！
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综上所述，私以为：2 X6 H4 [' t& c) X. c, I& \
1、消化时，大部分认为用胰蛋白酶+EDTA，也有小部分人认为，单独胰蛋白酶就足够了；
/ P6 o  l# P& r3 w. j  r7 `' j2、大部分人认为，事后可以通过离心去掉EDTA，确保它不会影响MSCs；小部分人认为，离心本身也会造成细胞损伤，不建议离心5 w7 O. U, n0 c) K/ @4 C
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科学啊，总是存在争议的，因为影响因素实在太多。笔者刚接触该领域，小硕一枚，所以就花了些时间研究了MSCs的分离培养，还是有些心得、疑问的。* w5 G9 [4 R/ l+ m$ Q
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那到底，事后需不需要离心呢？笔者在pubmed上拿出一篇伊朗人09年发表在《Nature Protocol》上的文章，该文章里面认为：胰蛋白酶+EDTA是最好的，事后不用离心。本protocol压根就没提及到离心！！所以，笔者更加倾向于不需离心，虽然笔者的实验尚未开始，还停留在收集文献，准备资料阶段，2月后开始。
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附上这篇protocol：
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元芳

要离心。; P" D% c: D2 t2 K" P2 }- q( |
EDTA螯合钙镁离子，进而影响细胞的黏附蛋白。

wangzhiqi86

离不离心也要视细胞状态、代次和类型决定的，大多数情况下不用离心，是认为对细胞没有影响。但这种影响的profiles是不是够全面呢，谁也说不清，说到底，是因为细胞对我们而言，毕竟只是一个黑箱，要想精确的弄清楚，很难。1 F9 P# G4 O: g2 I
至于EDTA的作用和对细胞影响，这个自然是要权衡利弊了，掌握好消化时间很关键，即使只有胰酶，时间长了，肯定对细胞再次贴附有影响，如果真的要弄清楚，那就需要准确做一个DOE平行实验了。

木木泥

我们实验室在养细胞时有人离心有人不离心，差别似乎不大，但是如果细胞背景不是很干净或是状态不是很好的时候一般会选择离心。miPS的培养手册上给的是离心而且是2次。。。供你参考吧

wen373

如果细胞比较脆弱，可以不离心，等细胞贴壁后，一定要换液。离心最好。

2420527

直接用胰酶就行了吧，而且效果很好，包括流式的结果都不错

wanglimaomao

我养过很多细胞，娇贵的干细胞，原代细胞，经得起折腾的一些肿瘤细胞，个人做法，控制好消化的火候，一般都是在细胞变圆，吸走胰酶，继续用细胞表面残留的消化液继续消化，到细胞可以以吹下来的情况下，加入培养液终止，轻轻吹下细胞，传代，根据细胞贴壁时间长短不同，一般内皮30分钟就可以了，如果底面铺胶，更容易贴壁，其他细胞可以观察一下规律，贴壁后换新鲜培养液，继续培养，先贴壁的细胞一般都是活力较好的，不好的细胞也筛选出去了。我个人不太喜欢离心，因为离心对细胞损伤其实也不小，尤其离心后重悬过程，如果细胞容易成团，就需要多次吹打，这对细胞损伤更大。再说，即使离心了，最后残留的胰酶，和我上述做法的残留的也差不多，而且离心的速度，时间的长短都对细胞有影响。减少离心，也减少了实验步骤，缩短时间，一般我传代5-10分钟，而其他人传代都需要30分钟左右。培养的细胞有时候还不如我这样的做法。所以，楼主可以借鉴一下，试试我的方法。

wanglimaomao

补充一点，我养过小鼠的原代MSC，基本也是用这种方法。很少离心，即使复苏细胞也是贴壁后换液，减少离心步骤。培养的细胞也很好。

阳光无畏

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我认同你的看法，我也准备不离心。谢谢你的建议。。

阳光无畏

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我认同你的看法，我也准备不离心。谢谢你的建议。。