求骨髓造血干细胞集落培养方案

AIR-JPC

培养造血干细胞，真是难呀！如题，求帮助！谢谢

ciweiyuan

顶一下，我也想知道. R& r$ J1 d; g/ P% C% D# D

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IMDM，30%fbs，SCF，IL3，epo，gcsf，GMcsf，IL6，甲基纤维素，具体含量我晚上再发给你，现在忘了

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(1)        将人造血干细胞集落培养基置于4℃冰箱，过夜解冻，解冻完后将培养基分装至无菌5mL离心管中，每管分装3mL，分装后置于-20℃保存，避免反复冻融。临用前4℃或常温解冻。) I. A' K( w& a& z7 T% R& ~4 v2 P
(2)        将MACS Buffer洗脱下来的造血干细胞用PBS以300g×5min离心洗涤一次，弃上清，用IMDM + 2% FBS调整细胞浓度至10倍的接种终浓度。例如，如果要得到每1mL培养基中含有1000个细胞的接种终浓度，则需用含2%FBS的IMDM调整细胞浓度至10000个/mL。根据前期实验摸索的结果，本研究采用的接种终浓度为500个/mL。因此，应将细胞浓度调整至5000个/mL。
7 m4 g! b1 S1 g! \(3)        将300ul已经调整好浓度的细胞加入含有3mL造血干细胞集落培养基的5mL离心管中（细胞体积：集落培养基体积=1:10），立即剧烈振荡使细胞与培养基充分混匀。室温静置5~10min，使气泡充分消散。
" P$ b" F1 A$ |# ]2 U(4)        将16号无菌注射器针头紧紧套在注射器上，缓慢吸取1.1mL含细胞的培养基至35mm的细胞培养皿中，每个5mL离心管中含有的3.3mL细胞和培养基刚好够接种至3个35mm细胞培养皿中，3个培养皿构成3个平行样。. L- M- e4 ~; m" M
(5)        缓慢倾斜并旋转培养皿，使黏稠的培养基均匀的铺满整个培养皿。7 a7 `# M. E9 n. ?5 R+ }
(6)        将2个接种了细胞的培养皿放入1个100mm的大培养皿中，另将一个不盖盖子的35mm培养皿也置于100mm大培养皿中，并且在不带盖子的35mm培养皿中加入3mL的无菌水，盖上100mm大培养皿的盖子，置于37℃，5% CO2，湿度>95%的培养箱中培养12天。培养期间注意观察不带盖子的35mm培养皿中水量，注意补水。
2 m4 ?: h! ]/ f8 T' ~, U0 u2 _(7)        培养12天后，在35mm培养皿的底部横竖各画两条线，构成九宫格，利于集落的计数。集落的计数需使用高质量的倒置显微镜，配有10×或12.5×的目镜，2×、 4×和10×的物镜，显微镜需带有蓝色滤光片，以利于观察红细胞集落。
( b1 W6 W  \2 C: d( m2 q4 p(8)        集落的判定标准如下：5 F- @  X! A6 b
CFU-E：: 红细胞集落形成单位，可形成1~2个包含有8~200个成红细胞的细胞簇，CFU-E是成熟的红细胞系的祖细胞，需要促红细胞生成素(EPO) 促进其分化。 ; v9 r0 l( e- ?. A
BFU-E：爆式红细胞集落形成单位，可形成单个或多个（3~8，9~16，>16）细胞簇组成的集落，每个集落包含>200个成红细胞。和CFU-E相比，BFU-E是更加不成熟的祖细胞，它需要红细胞生成素（EPO）和促爆式活性的其他细胞因子如白介素3(IL-3)和干细胞因子(SCF)，以促进其集落的最佳生长。CFU-E和 BFU-E形态学观察需要在使用蓝色滤光片模式下进行。
% `; q5 s7 R# G+ R  `5 t+ lCFU-GM：含有超过 40 个以上粒细胞和巨噬细胞的集落。可形成含有至少20个粒细胞(CFU-G)、巨噬细胞(CFU-M) 或具有两系细胞(CFU-GM) 的集落。
$ D, u2 f) c* X6 ]CFU-G：是含有超过 40个以上粒细胞的集落。
& k/ H  E, z( H8 J+ GCFU-M：是含有超过 40 个以上巨噬细胞的集落。* Y7 O% D8 o3 Z. H, i4 E
CFU-GEMM：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位。一个多潜能祖细胞能生成包含有成红细胞和至少其它两系细胞的集落。CFU-GEMM倾向于产生>500个细胞的大型的集落。
+ K- A; G4 {2 F6 T" {(9)        造血干细胞集落培养基：与液体培养基不同的是，造血干细胞集落培养基中添加了一定量的甲基纤维素，使培养基具有一定的粘稠度和半固体性质，支持造血干细胞的原位生长，从而利于对集落的形态学特征进行鉴定和分类计数。造血干细胞集落培养基内含1%甲基纤维素、30%FBS、1%牛血清白蛋白（BSA）、2mmol/L的L-谷氨酰胺（L-glutamine）、0.1mmol/L的2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、rhSCF 50 ng/mL、rhIL-3 20ng/mL、rhIL-6 20 ng/mL 、rhGM-CSF 20 ng/mL 、rhG-CSF 20 ng/mL，EPO3U/mL。
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