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发表于 2013-12-11 16:42 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

293细胞培养
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。  f0 ~: |$ `+ i7 @
1.培养基
DMEM  ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素1 I& A! p% l- [( H; j
2.复苏
37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3.传代
吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。
我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。
4.293细胞培养特性：
1)293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。
2)传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3)293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
4)复苏　293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 8 I3 f+ d3 m% A4 k, y! k. P
5)转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。
5.其它的经验：. S: g2 U, d9 L  j) c
1)用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取
2)培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，
3)要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。  i3 L. g9 j2 b0 Q& C. n, R0 o
4)如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。 + ^% J  P- o( H" `* b* k! T
5)如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。* j- G' c. u# T1 F' r
6.培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3, M7 Q& O& R& `, s6 g# D+ H
配置高糖的DMEM培养基1000ml， : H( k/ ?+ ~, H( L, p2 F$ }4 u
1)一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解
2)加入NaHCO3 2.0g . U* G7 |* e) |# H' W+ E
3)加入谷氨酰胺 0.146g（终浓度为5mM）
4)加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml） 7 m, d! H4 f: j4 A/ \
5)定容900ml , g) \6 D' I' k+ ?* ^7 g8 P
6)过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中 1 }8 q/ I. Y# y' ^4 t3 @( s
7)加入灭活小牛血清100ml。 % T2 A0 Y  q4 v4 J
7.L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。% G4 l& h' q  F, _
脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制时应加温30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于－20℃。使用时，在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1~4mmol/L。
8.DMEMF11培养液――取15．6 g DMEMF11溶于700～800 mL超声水中，加入3．7 g NaHCO3，用1 mol／L HCI或1 tool／L NaOH调节pH值至7．0～7．2，加超声水定容至1 000 mL，0．22 p,m滤膜过滤，根据需要加入5％～10％胎牛血清。. r$ i, T6 Q  K" T
9.柠檬酸盐细胞消化液――50 g KCI、22 g柠檬酸钠加超纯水至500 mL即为10×柠檬酸盐细胞消化液，高压蒸气消毒(1．034×lo5 Pa)15 min后4℃冰箱贮存。临用前以无菌超纯水稀释l0倍即为1×柠檬酸盐细胞消化液。
10.低代次293细胞培养基的配制DMEMF11 90 mL加FBS 10 mL，再加入青霉素和链霉素终浓度为100 U／mL。即为10％FBS的293细胞培养基。
11.细胞的复苏
快速取出冻存的低代次293细胞，将其安剖的底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。在超净工作台中，以70％乙醇对细胞安剖表面消毒，将细胞转移至75 cm 的细胞培养瓶中，加入10 mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。6～8 h后待细胞贴壁更换培养基。这与传统的方法——离心洗涤后再转人培养箱内培养不同。
12.细胞的传代
待细胞的融合度至90％，以1：2的比率传代。首先吸出培养基，然后加入1×柠檬酸盐细胞消化液3～5 mL洗2遍，留取0．5 mL 37℃消化5～10 min。将培养瓶在桌面轻轻敲打使细胞脱壁、漂浮、分散，为使细胞进一步分散可轻轻吹打几次。然后加入培养基3 mL，温和混匀，分别取1．5 mL细胞悬浮液加入2个25 cm 培养瓶中，再加入2 mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内继续培养。
13.细胞的冻存
待细胞融合度至90％左右，吸出培养基以1×柠檬酸盐细胞消化液消化分散细胞，方法同细胞传代。加入5 mL培养基中和消化液，200×g离心5 rain收集细胞沉淀，再以1 mL细胞冻存液(90％FBS+10％DMSO)重悬，一70℃或液氮中冻存。' Y) H6 ^5 r' a- n

文献报道，该细胞在培养过程中不容易贴壁，生长活力低，易造成损伤，而且随着传代次数的增加包装病毒的生物学特性会丢失。在培养过程中为减轻细胞损伤，可：% I3 [* K( k" w
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10 mL培养基中和细胞消化液，培养6～8 h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；
(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。细胞形态观察、贴壁率和生长曲线表明，这种方法对细胞损伤小，能维持细胞较好的生长状态。1 i0 o0 H: d8 @# w# \5 q1 x" H) W
NG等研究表明，低代次293细胞在培养过程中传代时融合度过高或过低，其整合的腺病毒El区基因易丢失；另外，不适当的传代比率也会导致细胞生物学特性发生改变。为此，笔者把细胞传代的融合度控制在90％左右，传代比率l：o以腺病毒感染质粒pFG140感染传l0代以后的低代次293细胞，可成功包装出腺病毒，表明这种传代方法可较好保持细胞的生物学特性。