多能干细胞的扩增

穿裙子的猫

之前进行了一次多能干细胞的扩增。步骤：96孔板预铺被饲养层细胞，4 r2 d+ M* Y* q$ K: d1 h
2－3天后挑取干细胞克隆，机械吹打，接种于饲养层上，加干细胞完全培4 H8 |( G$ [+ J9 p* _$ d  v3 X
养基100ul，干细胞克隆成活的不太好，请问各位老师们可有扩增的方法以及技巧呢？万分感谢呢！

ciweiyuan

1.建议不要用96孔板，孔太小，mef容易铺不均匀，改用12孔/ f: {2 C' i  @- \
2.挑取得克隆不要吹打的太小，否则不容易长起来, g1 Z0 R8 m9 y. Z1 P; i. w
3.不知道你的多能干细胞是人的还是小鼠的，小鼠的一般3天就能长起来，如果是人的，它的生长相对慢一些，建议你多等两天看看。& _% r6 w$ R' J  \7 l- W
4.如果还是不行，你可以加rock通路的抑制剂Y27632来抑制细胞的凋亡，提高细胞的存活率。
+ q2 N# r) i( c5。96孔板一个孔加100培养基是不是太多了呢，我一般是加50，加的太多，细胞容易缺氧对存活率也有影响的。
9 t+ k! F; y' ?3 B3 U  t$ p  J0 x2 E6机械吹打时请稍微轻柔一些。
- D( J) D1 v& c4 T0 @希望对你有帮助。

穿裙子的猫

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, x: M* e; B# L. y6 Y- K. L% L" o# t0 r0 E% f4 v4 }9 j
谢谢美女的答复，昨天又重铺了一个12孔板，我转染的细胞是人原代细胞，大概5天左右开始出现克隆。转染后48小时看了下荧光，只能看见零星的几个细胞发荧光，转染率基本是百分之几，我设的MOI值是15：1，是不是相对太少了？
" C3 g7 U8 v# `* o$ b, |另外，你看我的细胞图片，目前克隆周围出现分化和未分化的区分，看ES图片，别人的都是小颗粒样细胞啊！不知道是不是细胞来源不同造成的？

穿裙子的猫

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, O7 W' ?8 ~5 h7 W4 N- i% i
9 ~5 a; N' }0 N; H0 [& Y* W不好意思，图片没有传{:3_57:}上去

细胞海洋

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2 ]' W- A" i9 C# x0 y7 W! Q' s9 s
单个图片不要大于1000kb 可以裁剪或者截图

569981454

克隆团也可以用酶轻轻消化一下培养，96孔板空间太小了。

穿裙子的猫

回复 ciweiyuan 的帖子) X3 I" }) ]: \

# H6 G' O( D$ Y今天看传代的干细胞，果然是吹打的不宜太小，有一个孔的细胞现在已经开始成克隆样生长了，而吹打的太小的克隆，现在好像有点。。。都像单细胞了，估计长起来会很慢！0 V: j! W4 F  e% c+ Q) ?
谢谢你的经验!

穿裙子的猫

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7 h# N& \) i; B好的，谢谢！:lol

穿裙子的猫

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8 j. F: ^5 `' V  U
600多就传不上去了，怎么回事？版主？:L

细胞海洋

回复 穿裙子的猫 的帖子# z0 A  t! V- b# `6 `+ n9 i

; L3 Z, l; p; S! U5 F  d. D, c) j% \. z再试一次 应该没有问题