成脂分化问题，拜托各位前辈指点

lgdx1234

各位前辈好，我最近做ASC分化实验，用0.5mM IBMX，1μM Dexamethasone，10μM 胰岛素，200μM indomethacin来进行分化，每三天换液一次，分化三周时间。油红用异丙醇溶解的，用0.22微米过滤器过滤了两次。染色四十五分钟，染完了发现有很多红色块状漂浮物，染色效果也不理想。
5 n  T  R1 p1 U; Z7 |0 i, x细胞用逆转录PCR做过marker检测，该表达的都表达了，分化后的细胞也用逆转录PCR检测了FABP4，也有表达。
0 p& `' \% [- \- C* s请各位前辈给予指点。谢谢^^
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huangcong1988

个人经验来看，尽量不要把油红用滤器过滤，因为滤膜是脂溶性的，所以你染色后细胞里面会出现小的沉淀
* i9 e5 g- T9 a另外一个，你这个诱导时间也太长了吧，我们一般就8d就能诱导成功
/ S' O! Y( w0 [, X( k还有就是你的细胞是不是固定时间太长了，用的什么固定液呢？# K: y6 P; F0 o% k3 \2 x- J6 s) Z

lgdx1234

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* _( }- ?3 X- O7 I, \$ |9 T
我的固定液是4%的多聚甲醛，固定了10分钟，主要是诱导了很久只有少量细胞出现液滴，所以就持续诱导了很长时间。

huangcong1988

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: A9 I& ?1 n) z1 x! r+ f4 w固定十分钟能行？一般不是30min么？

lgdx1234

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十分钟没问题，我们实验室都是固定10分钟~

limeiying

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染色前镜下是否看见细胞内有脂滴？情况如何？

lgdx1234

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液滴不是很明显，但是感觉是有的，很小，有液滴的细胞比例很低。可以确认的是细胞不再分裂了，细胞数目在加入分化培养液后不变了。

huangcong1988

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分化培养基里面有10%血清么？

lgdx1234

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  X1 k7 @+ a' _2 e6 B有的 我加了10%的血清~

thuanger

原因找到了，是胰岛素过期了，用了新的分化效率很高。