Science：猴动物试验证明基因靶向编辑技术是可行的（附原文）

yinfuhua

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/ T. Q# P4 R- t0 {5 AScience：猴动物试验证明基因靶向编辑技术是可行的4 U# w0 z( J3 X7 Q4 D
2014-02-18 1 来源：lifeomics 作者：筱玥
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( I+ r+ _' U+ j1 W% R' Q$ u( o- u* \& s鲜活的证据。这一对双胞胎猴兄弟体内有两个基因发生了缺失突变，这两个突变是科学家们在它们还只是一个单细胞胚胎时人为造成的。
! D* |' B% R$ |/ ]  ]中国的一个科研小组近日对试验猴的基因组进行了精确的靶向编辑操作，证实这是一种非常有潜力的、成本相对低廉，又非常简便的基因组靶向编辑技术，可以用来构建人类疾病的灵长类动物模型。科研人员们利用最近发展起来的CRISPR基因组编辑技术（genome-editing technique）对一对短尾猴（cynomolgus monkey）胚胎里的两个基因进行了靶向人工编辑操作。据中国南京医科大学（Nanjing Medical University in China）的生殖生物学家Sha Jiahao介绍，这两个短尾猴顺利出生，在它们长到2.5个月大的时候看起来还是非常的健康，可是它们体内的绝大多数细胞都已经携带了人工造成的突变，Sha等人的这一工作成果已经在本周发表在了《细胞》（Cell）杂志上。* T& Z. y* o* _" k- S7 D8 J$ g' S2 X
美国麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）的神经科学家Guoping Feng也一直在尝试用CRISPR技术对试验动物猴进行人工遗传学改造，他评价道：“这是世界上第一次有人用试验成功地证实，CRISPR技术也可以被应用于灵长类动物，这一点非常重要。”由于CRISPR技术具有无与伦比的精确性，而且试验效率极高，所以一出现就获得了全世界科研人员们的热捧，并且已经在各种试验平台上进行了成功的尝试，比如人工培养的细胞、酵母，以及大鼠等试验动物，展现了该技术广阔的应用前景（Science, 23 August 2013, p. 833）。美国匹兹堡大学医学院（University of Pittsburgh School of Medicine in Pennsylvania）的生殖生物学家Gerald Schatten 也认为，Sha 等人的工作表明，CRISPR技术除了对生物医药领域具有极其重要的意义之外，将来也极有可能会给人类自身带来重要的影响，可以利用该技术对人类自身胚胎的遗传物质进行改造。5 R- M- ]# u- z' l8 Y! _2 q
Sha的试验发现，用CRISPR技术对短尾猴进行遗传改造的效率并不太高，远远不如小鼠或大鼠试验时的效率那么高。但是他们认为目前的这种成功率已经足够了，可以当作实验室里的一项常规操作。当然，进行CRISPR试验需要多个胚胎，也存在一定的失败率，这也提示我们该技术还有进一步提升的空间和必要。Feng的同事，美国麻省理工学院McGovern脑科学研究所（McGovern Institute for Brain Research at MIT）的神经科学家Robert Desimone认为，该技术还需要进行进一步完善，现在还不是用来进行灵长类动物改造的最佳时机。4 k& D$ d, y/ W  d$ \& Z" L, t2 I7 J7 E
Sha等人的工作成果并不是世界上第一个经过人工遗传改造的猴子，早在2000年时就有人用病毒载体往猴卵细胞里植入了绿色荧光蛋白GFP编码基因，得到了世界上第一只人工遗传改造的猴——ANDi（Science, 12 January 2001, p. 226）。在那之后，其他几个研究小组也陆续用其它猴做试验材料，植入了GFP基因，或者其它疾病相关基因，而且他们还发现，这些人工植入的基因可以被遗传给后代，说明可以用这种办法构建人类疾病的灵长类动物模型。不过这些试验都存在一个问题，那就是被植入的基因都是随机插入在猴基因组的任意位置上的。而CRISPR技术则可以在与靶位点DNA高度匹配的RNA分子的帮助和引领下，对基因组进行高特异性和高精度的改造。小鼠实验发现，使用CRISPR技术不仅能够在基因组中植入基因，还能够使基因缺失，或者对基因进行其它改造，这样就可以构造出多种疾病的猴动物模型。
) o; x; |# j+ f+ ~) `Sha与中国南京大学（Nanjing University）专门从事基因组编辑工作的生殖生物学家Huang Xingxu，以及中国云南灵长类动物生物医学研究重点实验室昆明科灵生物科技有限公司（Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research and Kunming Biomed International in China）的Ji Weizhi（他曾经在2010年成功构建了携带GFP基因的转基因猴）组成了联合课题组。该课题组决定在RAG-1基因（该基因对于B细胞和T细胞的发育至关重要）、NR0B1基因（该基因与动物的性别和胚胎干细胞的功能关系密切）和PPAR-γ基因（该基因编码了脂肪细胞里一个关键的蛋白质）这3个基因里引入突变。如果RAG-1基因发生了缺陷，那么就可以得到一个免疫缺陷病（immunodeficiency）的猴动物模型。7 P' _$ D5 k. p. y8 k
该课题组一共收集了198个猴卵细胞，并进行了人工授精操作，然后用与上述3个基因序列相匹配的RNA分子，和编码能够切割DNA链的Cas9蛋白的序列对这些单细胞胚胎进行了CRISPR试验。最后将83个活胚胎植入了29个代孕猴体内。最终有10个猴成功受孕，一共孕育了19只猴宝宝。不过有几只猴妈妈不幸流产，我们最开始介绍的那一对双胞胎兄弟Ningning和Mingming于去年11月出生，还有4位猴妈妈先后分娩，产下了猴宝宝。* D- s0 ~* [/ w; J4 c' J
这些猴宝宝到目前为止还没有表现出任何与突变基因相关，或者与其它基因变异（不过至少根据对84个可能存在脱靶效应的位点进行的研究发现，这种脱靶效应应该不会发生）相关的病变征象。不过这次试验只对上述3个基因中的2个基因进行了成功的突变，NR0B1基因并没有发生改变，而且Sha等人发现，在不同组织中，靶基因缺失的数量也并不完全一致。发生这种异质性现象可能是因为基因组编辑效应并不是在单细胞胚胎内马上发挥作用，而是发生了延迟，即等到胚胎发育到多细胞阶段时才开始发挥作用，可这时所有的细胞内发挥的基因组编辑效应并非都是平等的。美国马萨诸塞州Broad研究院（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts）的Feng Zhang是CRISPR技术的先驱者之一，他认为，如果我们想用CRISPR技术构建动物模型，那么这种异质性问题就必须得到解决。0 |9 n, E9 L" A$ G
世界上其他科学家们也都紧随Sha等人之后开展了类似的工作，比如Desimone、Feng, Zhang等人也都使用CRISPR技术尝试敲除过SHANK3基因（该基因能够导致人患上遗传性的自闭症），也都在中国将经过这种人工改造过的胚胎植入到试验猴体内，使试验猴受孕。日本的科学家也曾经使用类似的基因组编辑技术（锌指核酸酶技术）敲除过狨猴（marmoset）的SHANK3基因，以及免疫调节基因，不过这些工作都还没有发表。狨猴是一种体型更小，成熟速度更快的灵长类动物，所以用这种动物做实验经济成本更低。
' i/ x) w. }1 o! q- W" m; ~# F3 d( |Sha等人的成功能够打消很多人的疑虑，让那些一直犹豫不决的赞助人愿意为类似的研究掏腰包。美国麦迪逊市威斯康辛州国家灵长类动物研究中心（Wisconsin National Primate Research Center in Madison）的生殖生物学家Thaddeus Golos一直都在寻求资助，他们打算利用CRISPR技术开发帕金森氏病狨猴动物模型，Golos说道：“Sha等人的成功告诉我们，我们开展这项工作大概需要哪些条件和资源，可能会得到什么样的结果。相信很快就会出现大量与此技术相关的基金和课题申请。”
7 z6 U  h7 G& k7 b) G4 Z$ q7 Y没人期望很快就会诞生一大堆猴动物模型，因为这其中还牵涉伦理学问题和成本问题。但是对于阿尔茨海默病和自闭症这种复杂的疾病，猴动物模型还真就是一个不可替代的最佳选择。美国国立卫生研究所灵长类动物研究中心（National Primate Research Center Program at the U.S. National Institutes of Health in Bethesda, Maryland）的负责人John Harding认为，随着这类研究工作的不断开展，我们也会对CRISPR这项技术有更深入的了解和认识，能够知道该技术究竟可以给我们带来哪些帮助。9 F; q& [9 E* o% n% I
延伸阅读：
. ]. i: `& ?; o/ e  G5 s! H; YCell：里程碑成果！中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴
% K& R( U/ x! `3 [! ]原文检索：1 l, }1 f. X( h$ {" a9 V
Elizabeth Pennisi. Editing of Targeted Genes Proved Possible in Monkeys. Science 31 January 2014; DOI:10.1126/science.343.6170.476
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3 z3 v0 r& m* ^2楼原文 感谢have-a-rest 提供

have-a-rest

cynomolgus是食蟹猴。
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yinfuhua

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8 r' p* L( B8 R( k' F5 Z1 d+ }谢谢！

fwyou

那个 supplement information能提供一个吗？