求助，为什么我贴壁法养不出来细胞？

龟酱

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9 Y2 {: g5 l# [. S第一次培养MSC，我的方法是清洗并挤去脐带中残血后剥去血管，剩余组织（带羊膜）剪成1-3mm长小块，将组织块铺在10cm皿上（带羊膜的组织块华通氏胶那面贴皿面），然后把皿在安全柜里吹20min使组织贴壁，之后每皿加5mL完全培养基培养。
$ o  N# n. k6 [+ G现在已经两星期了还没有细胞爬出来，+ m+ B) U+ j* B7 S
想请教下各位前辈怎么贴壁培养msc呢？
* T8 u% ~/ Y' P" k: e是不是把皿放在安全柜里吹20分钟那有问题呢？+ W9 w! v/ D' l6 s
另外。。有些前辈说要将组织块倒置一段时间，请问是什么原理呢？
" R4 e5 b) v7 H2 V; c6 T谢谢大家

月_幻影

我们的做法是，将脐带去除残血后剥除血管，然后剥出华通氏胶，将华通氏胶充分剪碎后铺瓶（我们是直接铺到培养瓶中），然后在培养箱中倒置培养，第二天加入培养基后再将培养瓶正过来培养即可，加入培养基后静置培养一周左右，这段时间不去碰它，一周左右以后基本可以看出有部分细胞爬出，几次换液后会大量增殖。。。这个方法基本和书上介绍的相似，书上要求的是倒置培养3~4小时后再正过来加上培养液，其实倒置培养也是为了让组织块贴壁的，不过LZ就这样让组织块在安全柜内吹风个人觉得不妥，这样很容易就会使组织块脱水了，还怎么爬出细胞呢，而铺瓶后在培养箱中倒置培养最起码给了它一个比较适宜的环境让它去贴壁，所以我觉得LZ有必要改进下这个20分钟的吹风过程；再就是原代培养的前几天组织块其实是很容易漂浮起来的，所以再加入培养基后的一段时间内最好不要去碰它，先静置培养。。。希望可以帮到LZ。。。

龟酱

1 X# A1 E2 c9 a
9 k% h* `* z: ~2 {: P" q  ]回复 月_幻影 的帖子
) x5 p6 c6 p) v
% X# @. i' N/ d谢谢层主，明天就按前辈的方法倒置培养试试看。  d" d( N, [- t6 `) y
打算10cm的皿铺1cm的脐带组织块，组织块上滴几滴培养基后倒置培养过夜: K# h8 h0 ]2 {1 d9 s
确实按过去的方法把皿吹20分钟后组织块边缘变得比较干了。。5 W3 e$ F" e9 H8 j6 _* b# a
& ]- h$ ^8 g4 h
请问前辈，第二天加的培养基多少比较合适呢？# M5 r# Y% E! O  T8 a9 q7 g
有些学长说加5mL左右培养基防止组织块漂浮，但只有5mL的话培养基很容易变黄啊，而且据说原代培养前5天不要动培养皿；加10mL培养基又怕组织块飘起来，前辈怎么看呢？

月_幻影

回复 龟酱 的帖子1 g4 Z% H5 G1 j; [0 m1 f7 \

* U6 d8 ]% m& {! F7 E! P' O& \个人认为加10ml是可以的，不过加液的时候注意倾斜培养皿，在低端缓缓加入培养液慢慢放平培养皿使溶液缓慢覆盖整个皿底，整个过程要轻要慢；LZ不用担心组织块飘起的问题，因为一定会有一部分飘起来的，我这边在做培养的时候通常原代后第一次换液会飘起很多组织块的，不过已经贴壁爬出细胞的组织块是不受影响的，反而应该及时清理掉这些飘起的组织块，因为这些漂浮的组织块和一些细胞碎片什么的往往含有一些有害的物质，他们会影响原代细胞的生长，应该及时清除。
( A# V+ E2 D- b0 N5 i最后祝LZ成功！

青云之上

好像组织块法效果不是很好啊，酶消化法，直接单细胞培养多好~~

龟酱

回复 月_幻影 的帖子$ X- F9 r# L: `/ s! s
% \3 W* F! t' J* O
感谢前辈的热心解答，从前辈的回复中学到很多技巧，同样祝前辈以后的实验顺利！

龟酱

回复 青云之上 的帖子& X4 L0 Y  J3 D9 m' S- s4 A
4 }8 y; z/ W/ a4 a# M, Q( `
我们的课题是设计新的MSC分离方法，要做贴壁法当对照组。。。之前做这个实验的那个前辈休假了。。。* K7 P4 q' k2 }
而且很多人公认组织块法和酶法相比比较适合呢

cqstemcell

觉得在安全柜里吹20分钟不太妥当，我们的做法是倒置放培养箱中3-4小时后再加入培养液培养，一般都会长出细胞的，还没遇见过没长出来的情况

cloudy1234

只是去除血管肯定是不够的，我们取得是华通氏胶，要把表皮都去掉。我们是将华通氏胶取出之后，进行剪碎，加4ml培养基，平铺到T75培养瓶中，放置20min左右之后放到培养箱中培养，每隔2-3天进行换液，一般两周之内便可进行传代。个人认为脐带的组织块法比较好

jojo1988509

我是要倒置的，我看到人家有的说提前用血清润一下培养瓶会更好呢，操作没有问题的话你就再等等吧。