求hES的复苏、冻存和传代方法（详解）

mecol

我是新手，准备养H9，最近也在学这方面的技术，在这里还请各位专家分享一下养H9的经验，最好详细一些，谢谢！

细胞海洋

寻关于th9细胞的早期文献
1 u# |7 Y, h- P! _/ P# chttp://www.stemcell8.cn/thread-17340-1-1.html
2 J/ d' B7 Q! z% V2 _% x

mecol

回复 细胞海洋 的帖子. a- w9 ~6 p" x7 @. O
! Q6 u* G' G, s+ d
这个完全不相关吧，我要的是人胚胎干细胞（H9 line），不过谢谢啊

shaozi402

看过一些文献，H9和H1的培养、冻存及分化等方面很相似的

mecol

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4 ^2 a, Z  c- F8 T  U6 I* ~$ v! q5 i* @7 v/ M. R2 O8 \
求详解啊，我还在学习中，谢谢

shaozi402

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1 s( r2 b6 W! a5 t  l4 Z9 u6 Q8 X0 o
这里是H1的培养方法，恢复帖子不知道怎么上传文件，这是题目：Production and transplantation of retinal cells from human and mouse embryonic stem cells

细胞海洋

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' A' j+ F; J) ?6 ~0 Z! S' e. H7 K- b& a. Z6 w/ ~5 _
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青云之上

2 f1 S9 i) H9 C$ D8 S! G7 y) @" ]

mecol

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+ O4 q$ ^# v4 C
  N9 h% V# i& p' g" g谢谢啊

MZzhang

hESCs解冻
* |: j" H' D7 ?$ u. c从4℃拿出解冻细胞用的培养液，5mL加入到10mL离心管中。
8 d$ a  d7 H. \9 Z* U) v在Matrigel培养板做好标记。  c* x# D! o) d* G
从液氮罐中拿出需要解冻的细胞，拧紧冻存管盖。将冻存管放入37℃水浴锅中，待冻存管中冰块完全溶解。擦干管壁、管盖上的水。冻存管拿入工作台中。9 l  v  {$ K) P, H/ l0 K/ @% g
吸去Matrigel培养板中上清，加入hESCs培养液。(12孔板预先加入500μL)7 W; f8 U  o: M" N7 p+ n/ B: i
用剪口枪头将冻存管中的细胞，移入10mL离心管中，轻轻吹打、混匀。$ D; o1 m- M) z8 g# V) E. y
1000rpm离心5min。
6 N- c* @! H/ b1 T! ?4 k  }: Q5 h7 c2 P离心后，稍稍倾斜10mL离心管，用剪口黄枪头贴管壁，吸去上清。- i7 S6 I7 n5 n- q
向10mL离心管中加入1mL hESCs培养液(剪口枪头)，轻轻重悬，1mL分装2孔(每孔500μL)，最终每孔1mL培养液。
  N& V9 X( I0 p, i5 p7 c/ K  }3 h# p镜下观察，摇晃培养板，混匀细胞。% R) T% s; Y+ U0 x1 d
37℃培养。( o& t3 J- P/ M6 W& c+ V  [' N$ r
hESCs 6-10h贴壁。6 O: K9 t$ r4 }- {; {

- P5 A/ R9 y, }( L4 [+ w3 IhESCs冻存
2 m' Z) B2 j4 ^- ?) d0 zhESCs吸去mTeSR培养液，加入dispase消化5-7min(一般hESCs传代为5min)；
; R- A9 M* O+ g  d3 I4 L8 B消化后吸去dispase，用DM/F12洗2-3次；
! v+ M0 p! N) f- e再加入DM/F12，用剪口枪头刮细胞(朝一个方向，枪头内有培养液，边刮边打出培养液，以防细胞干燥)，重复1-2次(尽量完全收集细胞)；
- [7 a, I$ @3 n1 m- q% b4 ~1000rpm离心5min，弃上清。
' \) R( U4 i7 \. M9 Y* x4 m* B加入FMox重悬细胞(12孔板每孔500μL FMox，每支冻存管加500μLFMox )。1 \4 F4 Q5 n! m  L3 f0 i2 z: v
冻存管： 细胞类型、代次* C2 ]) B* I7 w# T1 t' d
         培养基
: b. d% v3 J! i! M4 b* u- d% ~         转入或干扰基因
( j2 }$ T, w& v/ m: P+ V         冻存时间、冻存人: @$ U/ s& g! d- l

  O  c/ C: `6 o. ]: r4 OhESCs传代
/ D2 k+ h. B0 o; l: b% ]1.dispase 克隆传代
3 y+ Y0 Z4 m! H剪口枪头吸去培养液，加入dispase酶，消化5-7min(消化5min后观察，克隆边缘出现卷起，小黑圈)，加入DM/F12培养液洗3次(对角线两点轻轻吹洗细胞)，加入mTeSR medium，剪口枪头朝一个方向刮细胞，1传3-4细胞。) y# P) p: L2 E. D8 {
2.accutase 单细胞传代
8 p; O# |9 S. h0 o% A剪口枪头吸去培养液，再加入accutase酶，消化1-2min(消化1min观察，克隆中细胞变亮，悬起)，将上述悬液加入有5mL DM/F12的离心管，1000rpm离心5min，离心后弃上清，加入Y27632(1:1000) mTeSR medium重悬。细胞计数，接种细胞5000 cells/孔(6孔板)。7 p: c- x9 v1 ^% h2 O* v