AdvCell® NK细胞无血清培养基

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       AdvCell® NK细胞无血清培养基﹙BNKSFM0001﹚是为哺乳生物来源的NK细胞培养而设计的， 培养基包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质、血清替代物以及其他补给成分。产品严格无菌，无病毒和支原体，性能稳定的核心是采用无血清替代物为细胞提供一个营养全面和平衡的环境，不仅包括NK细胞生长的一切养分，还包括促进DC细胞吸附、活化、增殖的添加物，产品适用于人及哺乳类动物NK细胞的培养、活化及增殖。

★ 产品号   
    Cat NO: BNKSFM0001

★ 产品名称
名称                                                                                产品号                          规格             储藏条件            运输
AdvCell® 免疫细胞基本培养基
（AdvCell® Immune Cell Base Medium）                        BICBM0001                  500 ml            2-8℃/ 避光            冰袋
AdvCell® 免疫细胞添加物A
（AdvCell® Immune Cell Culture Supplement A）        BICS0001A                  20 ml            -20℃/ 避光            干冰
AdvCell® 免疫细胞添加物B
（AdvCell® Immune Cell Culture Supplement B）        BICS0001B                  1 ml            -20℃/ 避光            干冰
AdvCell® 细胞垫
（AdvCell® Cellpad ）                                                BCP0001                          100 ml            2-8℃/避光            冰袋
AdvCell® NK细胞吸附物
（AdvCell® NK Cell Adheresin)                                        BNKA001                          1 ml            -20℃/ 避光            干冰
AdvCell® NK细胞添加物A
（AdvCell® NK Cell Culture Supplement A）                BNKS001A                  1 ml            -20℃/ 避光            干冰
dvCell® NK细胞添加物B
（AdvCell® NK Cell Culture Supplement B）                BNKS001B                  1 ml            -20℃/ 避光            干冰

★ 产品适用范围
   适用于人及哺乳类来源的NK免疫细胞的培养、活化及扩增。

★ 培养条件
    37℃，5％ CO2  无菌恒温培养。

★ 操作步骤
1.培养皿的包被：按一个10-cm培养皿的表面积计算，将2 ml  AdvCell® 细胞垫 (BCP0001)与20 μl AdvCell® NK细胞附物(BNKA001)混合后加入培养皿中，4℃下包被过夜。
2.按常规免疫细胞培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋中高密度培养，应优化条件来确定最佳的操作步骤。使用前将BNSFM0001中的5种组分按如下体积比在37℃下解冻之后混合混合成完全培养基: 500 ml AdvCell® 免疫细胞基本培养基（BICBM0001）、20 ml AdvCell® 免疫细胞添加物A （BICS0001A）、1 ml AdvCell® 免疫细胞添加物B（BICS0001B）、1 ml AdvCell®  NK细胞添加物 A(BNKS001A)、1 ml AdvCell® NK细胞添加物 B(BNKS001B)。
3.抽取患者外周血50 ml，将采集的血样转入50 ml 离心管，2000 rpm离心10 min。离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血清于新的 50 ml 离心管，盖好离心管盖于 40℃水浴锅中孵育 30 min。 孵育结束后，再 1400 rpm(340 g)离心 10 min,吸取上清于新的离心管保存 4℃备用。
4.用移液管将下层的血细胞与生理盐水 1:1 混匀，按 1：1 将悬液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管（注意：不要打乱液面分界保持液面分层明显）。 将离心机的升速与降速调至最低，400 g 离心 30 min；离心结束后，用 5 ml 移液管吸取中间白膜层于新的 50 ml 离心管，并用生理盐水洗涤离心两次，以去除多余血细胞。
5.根据计数结果调整细胞浓度，充分混匀后按 1- 2×106/ml 密度接种于含免疫细胞基本培养基（BICBM0001）的培养瓶中，并按10-cm培养皿的表面积添加20 μl AdvCell® NK细胞添加物B（BNKS001B）。当细胞生长到第三天离心换液 （ 340 g离心10 min ）更换新鲜培养基及AdvCell® NK细胞添加物B。
6.以后 4-6 天每天镜检观察，根据细胞悬液颜色添加培养液，每次添加应为总体积的三分之一左右。 第七天计数，当细胞量大于 6×107 时，则添加AdvCell® NK细胞添加物B；如细胞数量在 3-6 ×107 时，则长至第八天添加 AdvCell® NK细胞添加物B，加液时使总细胞浓度保持在 1-1.5 ×106cell/ml。
7.当培养液体积大于 150 ml 或细胞数量大于 1.5 ×108 时则需转移至培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）。第 8-11 天每天镜检观察计数，根据细胞悬液颜色加培养液。第 12-14 天观察需加液时，细胞浓度需保持在 2 ×106cell/ml。 当细胞达到所需剂量时，即可离心收集细胞待用。