白血病及淋巴瘤临床免疫分型

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文字：北京协和医院 崔巍# w, j- ~* y3 f# }4 c
中山大学附属第一医院 陈运贤
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5 g9 X" }( d; P1 l正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原，这又增加了白血病免疫分型的复杂性。
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近年来白血病/淋巴瘤的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术（FCM）白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。因为FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜，浆，核的抗原表达。另一个重要理由是至今尚未发现白血病/淋巴瘤的特异抗原。所以能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。抗原表达与其相应系列/阶段的血细胞无明显差异。与形态学检查相似仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性。单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。因此，近年来主张用设门（gating）方法。即用CD45与侧向角（side scatter, SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原。其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC最高，依次为单核细胞，淋巴细胞，blasts，红细胞。以CD45/SSC双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来。若同时加上一个，二个甚或三个荧光标记的单抗，则很容易识别非正常细胞群所表达的抗原。这样可以排除正常细胞的干扰。在幼稚细胞％低的情况下或检测残存白血病时尤为必要 。FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在10000～50000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。' [8 y1 V4 S1 \3 h, I& j; {/ ^

, r+ O3 R( M' u4 \# G1 p流式细胞术白血病免疫分型的临床意义1 ]0 f6 O! B5 N1 H5 a6 ?' w3 r

$ `' \. S  ~& N+ Z4 p骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：1、用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。2、形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。3、混合性白血病。4、部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。5、慢性淋巴细胞白血病。6、微小残留白血病。- e/ u) ^0 o2 {& S; U# p& u( Z( q

; i* @' V. a6 T( _1 g9 X免疫分型常用的免疫标志及其意义
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白血病系列分化抗原; ~# U9 d9 K6 d5 E% N+ l8 Q
T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。
0 ]8 [7 |, s# K  z2 P  m' eB淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。
. C1 D1 \+ ^6 M9 mNK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。
  p7 ?" N7 F0 Z( E0 H髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。
2 q5 j8 X" B& S% p% d% N6 W红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。
5 o" b2 B# Q: q! f) p6 q2 A巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。
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' Q, x5 I; P' I; ]8 ]: F0 o. _白血病系列非特异性抗原
. j& h$ C" b+ W: r  cCD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。4 g3 z5 X0 h6 S+ t' w

- @' P6 m" V+ J4 l& ^白血病分化阶段抗原
* O* v5 e6 W2 D8 Q. t. j. x& i6 ST细胞抗原CD4、CD8。
1 w# B5 v% q; e# D! cB细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。5 C4 h( @/ |0 X$ w4 |1 m9 {3 L

7 p& `, ]) Z7 v; G4 N3 t; a白细胞共同抗原
9 |% X) s, q4 M; f. E# iCD45为白细胞共同抗原，但原幼细胞表达量比成熟淋巴细胞低，幼红细胞不表达。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。
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白血病及淋巴瘤免疫分型- Q, C7 ~$ r7 O* s0 o

5 B9 v( r& }8 j9 w, t8 J一、AML
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( d: m0 v" n/ g" T2 ?% e# w9 ZMO： Mo blasts有低的SSC和FSC。在CD45－SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4。Mo blasts一般HLA－DR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。
8 D, Y+ {, h7 Z5 J! A3 nM1： 流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表达少于M0，可能表达部分CD15。4 B+ m6 o, P8 o+ f; @3 k
M2： M0与M1的主要区别是成熟度增加，blasts减少，CD15较M1较显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLA－DR（-）。CD45－SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
0 H$ X1 M3 c; Y8 Z" p: KM3： 高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟C少，多数情况HLA－DR（-）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表达。% ^$ ]6 Z7 y, u" G9 T" C
M4与M5： 两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD45－SSC图上，成熟C出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（＋）。
' H* C4 [, u7 o3 ?2 d- I6 U5 G+ `M6： M6较少见且特征不明显，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33阳性，CD45－SSC图显示主要为红系成份。( }5 }; h2 _; L, i
M7： 巨核细胞白血病，在AML中少于1％。一般CD61（GpⅢa）和/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）阳性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测GpⅡb/Ⅲa与CD34以减少激活血小板的粘附。
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二、ALL：$ `# r+ h% n8 `6 Y+ C. a. W

* Z% j; F! q' t. j" ]; \* qALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25％，在成人，ALL约占急性白血病的25％，我们将ALL分为B祖细胞型，CD10＋或CD10－，前B细胞型，B细胞型，T细胞型。- \5 y- `( @; y* G
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B祖细胞型ALL：, a2 |4 i: J4 `9 U
在幼儿约占ALL的65％～70％，青少年为55％～60％，成人为50％。在儿童，约90％病例CD10＋，在幼儿只有少于50％病例CD10＋，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB标准的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分为2个亚型，CD10＋和CD10－，前者预后好，多数病例CD24＋，CD34＋，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg-。
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前B细胞型ALL：# `- J# ?5 P$ j- @! _
此亚型约占儿童ALL的25％，细胞一般为CD19＋，CD24，HLA－DR＋，胞浆CD22＋，CD10＋，TdT随CD20变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t(1；19)出现相关并由此产生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型为CD19＋、CD10＋、CD9＋，不同程度CD20表达，CD34－，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。
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B细胞型ALL：
5 u* Z- r3 }4 }- Q# W5 @8 I2 f成熟B细胞型ALL约占ALL2％～5％，B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45－SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）多数病例CD10＋。但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞ALL无FAB－L3形态。
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8 D3 I3 Y/ Y3 E8 @  c/ S; u( cT－ALL：/ |0 D) g7 }2 C& U
多数病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少见TdT表达。前T细胞亚型，表达CD7胞浆CD3＋且无其它T细胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它异常抗原组合。! x1 y, \1 P% [1 p- N% x
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杂合型白血病：1 |. c4 q2 j6 F% a6 M
随着流式技术的广泛应用，我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t(9；22)或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B系、T系、髓系分别为CD22、CD3和MPO。
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* R: B5 Y$ ?! C7 _, n" B5 Y9 }! [三、CML：! o( Z5 F0 O0 ~7 P( N
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由于慢性期显著的细胞分化，在CD45－SSC图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CML可确诊，如有Ph1即t(9;22)(q34;q11)，它可形成新的杂合BCR－ABL癌基因，其产生的一段8.5kb异常，RNA可编码一个210－KD（P210）的融合蛋白，使正常的造血细胞转变为CML细胞，该产物可用CR扩增后用标记探针在流式细胞仪上检测，这种分子流式技术正在研究中并将使流式技术扩展到分子领域。, Q9 r8 v% C; R; b% m
CML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续1年左右最终发展为加速期和急变期。流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。直接影响到治疗效果。- i! u: G+ L, E2 ~" ~; M' s
急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为CD10＋B祖细胞ALL极少有T细胞型ALL。+ P0 M/ c: F  H4 b/ E( {6 M

3 d6 e" s6 X8 A. Q* U% n' t+ F四、CLL：
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+ K" [' g( m1 ICLL细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。免疫分型主要为：SIgM、SIgD弱表达，B系抗原为CD19、CD20、CD43、CD79a与CD5共表达，CD23表达使得CLL区别于帽细胞淋巴癌MU，即（CLL：CD23＋，MCL：CD23－），CD10－、CD23－、CD11c和CD25、CD20常弱表达，尽管CLL起病慢，但CLL病人的生存率变化很大，有染色体异常的病预后不良，最常见的三联体trisony12、14q、13q、11q，免疫表型上没有特异的变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常。最近，有研究表明，三联体trisony12与SIg、CD20表达量高度相关，与CD23－相关 与FMC7相关。7 W0 Q3 |4 r  U2 E( G: W$ o
B型前淋巴细胞白血病（B－DLL）较CLL更为严重，流式细胞技术在区分B－DLL和CLL上发挥很大作用，B－DLL多为CD5－，CD22＋，表达更强的sig。6 x0 o" ~/ T* y+ L/ h
MU病人平均生存率不超过5年，与CLL在形态上很难区分，与CLL相似有CD5＋B祖细胞，但Sig表达强于CLL，且CD22－。- A" R0 Z; z- t4 b+ B7 R) X3 _1 l
另一与CLL难于区分的是FCC，细胞为强Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：对于诊断为CLL，CD5、FMC7、CD22与SIg，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为DLL、MCC或CLL的亚型（trisomy12）因为它们危险性更大。: Z5 g+ Z5 D  N' s2 x8 N1 t
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五、淋巴瘤：
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流式技术在淋巴瘤诊断中起重要作用，标本多取自淋巴结或细针穿刺(FNA)，FNA获得的标本用免疫分型作诊断可免除病人昂贵的手术过程，是细胞形态学诊断重要的辅助手段，诊断特异的淋巴瘤便于有效的抗体组合，因此流式多参数分析极有价值。此外，许多淋巴瘤和白血病表现出一些特征性的抗原密度改变如CLL/SU中，CD20减少，HCL中CD20增加，SIg在SLL中密度下降，而在FCC中密度上升。流式定量技术同样具有重要意义，流式技术可对单个细胞的DNA含量作定量分析，确定处于不同细胞周期的各群细胞数。由于染色体改变而产生的异结体细胞数亦可被检测到，S期细胞数对特定淋巴瘤的诊断具重要意义，流式还可通过检测Ki-67表位的表达确定增殖群体，Ki-67-增殖相关抗原在最近的研究中显示与两种预后不非何杰金氏瘤有关。. X- u# K  d  {8 V" Z7 ^9 k5 |, I) {
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六、MCL：帽细胞淋巴瘤6 L% n! l2 t% @8 f3 r; m& d
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为B系肿瘤，表达CD19、CD20、CD22、CD43，λ比κ更多见，IgD弱或阴性，多数病例CD5＋、CD23-，通常阴性CD10，但有时与CD5共表达。CD5＋。CD23-、Ig的类别有助于使MCL区别于FCC。Ig轻链的表达，IgM、弱IgD、CD23－、CD20更强的表达有助于使MU区别于CLL/SLL、缺乏CD11c、CD103，一般CD25-，使之区别于HCL。
. W( l% ?* ~$ v- c$ G. L+ a免疫分型与形态学及临床结合可把MCL与其它淋巴系肿瘤区分开，这一点很重要因为其它肿瘤是低分级而MCL不是，平均生存率少于5年，治疗并不乐观。
8 G  P2 w2 }6 C" R! p- M" X5 w, n5 [* fMCL与特异的基因改变相关t(11;14)(q13;32)，导致原癌基因BCL-1/PRAD-1重排过度表达cyclinD1蛋白，见于约50～60％MCL，并可通过PCR扩增检测到。当病人CD5＋，BCL-1重排，CD20＋，CD10－，预后不良PRAD－1/cyclinD1是MCL高度灵敏的特异性分子标志，用透膜剂处理细胞后用流式多参数分析方法检测cyclinD1是一个极好的诊断技术，可能会优于分子学方法。8 v- U  `2 P% j* a& i
尽管cyclinD1过度表达是MCL敏感特异的指标，但其水平与临床表现并无相关 性。有研究表明P53过度表达与疾病进程相关，可以应用于流式多参数分析。
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% W) `, R) `; h七、HCL 毛细胞型白血病：4 _6 J: E6 ~# o7 N- |4 D0 v* P

$ D5 R: R# c1 W% R0 {0 `HCL少见，但却是较易辩认的B系淋巴细胞增生性疾病。瘤细胞一般表达B系抗原CD19、CD20、CD22、CD79a，且为Sig＋，重链多为IgM和IgD、Sig中度表达、多CD21，经常CD5－，CD10－、CD20－。CD11c和CD22强表达CD25中度表达、免疫表型提示是一个晚于CLL和PLL的发展阶段，基因重排分析支持这一结论。粘膜淋巴细胞抗原CD103是使HCL区别于其它B系白血病的最可信的标志。CD103表位属整合素家庭同时在粘膜相关T细胞和某些激活淋巴细胞上表达流式细胞仪应用这一标志物可发现骨髓微小残余病变，且灵敏度在1％以下。
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/ P) Z6 y3 l& A. \八、外周T细胞肿瘤：1 m/ t* L; I3 \3 a3 o

4 ]( M; I; Z. b1 v8 @与胸腺型T－ALL和原始淋巴细胞型淋巴瘤不同。这组疾病是以外周T细胞亚型为特征的，主要为CD3与CD4或CD8共表达，这些肿瘤多表达α－β或ν－δ型T细胞受体，尽管肿瘤CD4＋和CD8＋两种为主，但CD4与CD8并不能作为系特异性标志，有些变异的亚型，特别是丧失全部T细胞抗原的亚型在这组疾病也很常见。许多过去称为T－CLL，但其中大多数如今可进一步分类。
) i  \* i3 }0 y1 x9 t某些研究认为，最常见的是胸腺后期亚型T－PLL，约占此类疾病的1/3，病人 表现为白细胞增多症（经常>100,000）。脾肿大，淋巴结病，免疫表现为CD2＋，CD3＋，CD5＋，CD7＋，多数为CD4＋，CD8－但偶尔也可有CD4、CD8共表达，CD8单独表达的极少。CD4＋CD8－表型疗效好。T－PLL较之B－PLL更严重。! Z; T  K9 N5 M4 H- P. [' ^2 R9 K
我们认为，大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）较T－PLL更常见，细胞典型形态为大颗粒淋巴细胞，轻至中度淋巴细胞增多常伴以中性粒细胞减少，常见两种亚型，T细胞型（T－LGL）表达CD3，弱CD8，CD2和一些NK细胞标志如CD16，参16，CD57。多数CD56－，CD5－，CD7－，CD4－，CD25－这些病例强表现出T细胞受体基因重排且与类风湿性关节炎显著相关；另一较少见的亚型为NK细胞型（NK－LGL）表达CD2，CD56，CD16，多数无CD3，CD4，TCRα－β，CD8和CD57弱或无表达，这型无TCR基因重排，且临床表现出更明显的贫血、肝脾肿大、血小板减少等症状。所有亚型多进展平稳，但CD3＋，CD56＋变异型T－LGL较为凶险。; M5 f% E  c5 K$ D' j
MF和SS，都为CD4＋也表达CD2、CD3，CD5、CD7有时也阴性，很少有CD8表达。缺乏异常表型和特异形态表现，使诊断难度增加，TCRβ基因重排有助于区分淋巴瘤和其它良性疾病。新的分子学方法有助于诊断和监测微小残余病变，MF和SS占表皮淋巴瘤的绝大部分，其余的多为B系和T系细胞混合性淋巴瘤。尽管罕见，但有报道MF和SS病人中发现T系细胞白血病病毒Ⅰ、Ⅱ（HTLV）。# V/ C' `) B' R/ _4 c2 ?
成人T细胞淋巴瘤――白血病，与HTLVⅠ相关具有激活的T细胞表型，表达TCR，CD3，CD4，CD5，HLA－DR以及强的CD25，细胞多为CD7－、CD8－，流式细胞技术，还可检测到粘附分子L－selectin的异常过度表达。P53异常也与疾病进程有关。+ e  I, J! m) r1 _4 y% N2 C! G
Lennert’s淋巴瘤也是CD4＋外周T细胞淋巴瘤，形态学上与何杰金氏瘤难于区分。根据我们的经验，何杰金氏瘤是良性的CD4＋小淋巴细胞，所以除非Lennert’s淋巴瘤表达出异常的T细胞抗原组合，否则流式的鉴别诊断作用很小。
% [' R7 G: R1 O9 J  D: ~* A: O其余一些未分类的表达外周T细胞表型的淋巴细胞白血病，在所有病例中不到1％。形态学上细胞类似典型的CLL，但临床上疾病进程更为凶险，多数病例CD2＋，CD3＋，CD5＋，CD7＋，CD4＋，极少CD8＋。这些可能是T细胞的CLL，但是却表现出不同的临床进程。我们建议分类独立于CLL。, L5 v: E/ f7 e) B+ k
由于形态学及免疫表型上的重叠，外周T细胞肿瘤难于鉴别诊断。基因学方法有助于区别低级与高级分类。必须在多方法结合的基础上进行诊断。区分不同型的外周T细胞肿瘤非常重要。不同型对治疗反应不同，分型有助于指导治疗，并决定是否进行骨髓移植8 J3 z" o2 y7 g; Q3 l5 E& t
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九、大细胞淋巴瘤LCL：% F! b% T4 K7 _4 I0 ~8 @( i

/ F' |- p2 @! u LCL淋巴瘤占成人淋巴瘤的40％，在儿童中占30％。在成人80％是B细胞，而在儿童LCL平均分为B细胞、T细胞及不确定型。约40％病例，CD30＋。免疫表型有助于确诊LCL。T细胞型较其它两型严重，S期部分增多预示更为凶险的病程。LCL多见与B细胞表型相关的BCL－6基因重排，且预后好。" A' |. Y2 V5 _+ U6 s5 v1 l
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十、何杰金氏病：; e. `; v# [6 m# u* n& ^

. K- C. v2 |1 O; ?/ E9 q4 k" I何杰金氏病是一种区别于其他肿瘤的恶性肿瘤，在形态上可确认的肿瘤细胞不足1％，多数为炎症细胞，所以多数病例在流式上只有非特异显示。限制了流式在何杰金氏病中的应用，对Reed-sternberg细胞的研究难度很大，有报道T、B细胞表面标志及T细胞受体，Ig的基因重排，在一项研究中，发现具B细胞免疫表型的何杰金氏病人Reed-sternberg细胞CD30＋，有重排的VH基因。对具结节性硬化、淋巴细胞缺失、混合细胞型，何杰金氏病人的免疫表型研究发现，CD30＋、CD70＋、CD15＋，且多CD45－，在有些病人可用CD15/CD30双色分析确定Reed-sternberg细胞，但灵敏度很低，半数病例表达T细胞表面标志如CD2、CD3、CD4，B细胞表面标志如CD19，CD20，CD22在这一亚型极少表达。结节淋巴细胞为主的何杰金氏病被认为是B细胞型的，此型Reed-sternberg细胞表达CD20，B异性丁链，CD45，但不表达CD30、CD70、CD15，可在Reed-sternberg细胞表面发现细胞激活标志如CD25、HLA－DR和CD在，在抗原表达细胞出现的B7/BB1，是T细胞的CD28和CLA－4配体，在R－S细胞上可见表达，属于TNF受体超家庭的CD40在Reed-sternberg也有表达。除对Reed-sternberg细胞免疫表型的研究外，流式对何杰金氏病的研究只显示以T细胞为主（主要为CD4）的混合成份。有报道，在富含T细胞的B细胞瘤病人可见CD8为主，这种变异性LCL尽管形态上与富含淋巴细胞的何杰金氏病相似，但需不同的治% x/ o  b5 U3 q& f& J

" o' h# z1 z2 L3 M* R- s十一、疾病监测
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) U, S# ?1 G4 v! s- Y6 W: k本部简略介绍流式技术在疾病监控中的作用。3 R7 ?+ z( @* X: y, S8 T
检测微小残余病变（MRD）主要采用散射角与肿瘤特异性抗原荧光标志相结合的多参数组合，分析灵敏度在1/1000～1/10000，不排除单个抗体即可做出特异诊断的情况，如7.1抗体与儿童期ALL（11q）细胞上独特的表面蛋白结合，如果采用固定及透膜技术流式还可检测胞内抗原，可供检测的组织包括骨髓、外周血、脑穿液及其他体液。依赖异常的免疫表型的表达来检测肿瘤细胞需要清楚正常免疫表型表达的情况。TdT只在处于胸腺的T细胞及有限的骨髓细胞发达多数ALL和原始淋巴细胞淋巴瘤表达TdT，因此如在外周血和脑穿液发现含TdT的是可明确为瘤细胞。! F4 a2 p+ S3 p3 i% o& y  l4 @  ^
多数B系ALL表达TdT、CD19、CD10，一小部分表达CD34，这些标志的任意组合加上某些异常标志如CD13、CD33、CD15即可将ALL细胞与正常骨髓与外周血细胞分开。诊断T－ALL时可应用TdT与T细胞表面标志如CD5，CD5加上胞浆CD3的组合，该方法的灵敏度可达92％，特异性表达75％。在AML包括CD34、CD56在内的多种标志组合，表达TdT，共表达淋系抗原（如CD7、CD19）与散射光及抗原密度，可确定AML诊断的灵敏度。有关慢性淋巴细胞增生性的疾病资料很少，用流式双参数分析检测FCL灵敏度可达1％以下。采用的标志包括，CD103、CD22共表达，CD11c和CD19的强表达，CD19和CD25的强表达，FCL的CD11c的表达强度为CLL/SSL的30倍。CD25为6倍，这些双参数为FCL特有，其中CD103和CD22共表达特异性最强。流式可鉴诊外周血和骨髓的CLL，CD5与CD20或CD19共表达，具有κ和λ轻链的CD5可使微小残余病变的检测灵敏度达5％以下。应用CD5、CD20或CD19、κ和λ进行三色分析，可使检测灵敏度达1％以下。体外MRD的检测灵敏度是否具有诊断意义，是一个重要的问题。多项研究表明，多参数流式分析是评估MRD的快速、准确、经济且可对疗效进行预测的理想方法。
% ]7 [) J4 D& [. o  m流式细胞仪另一项新的应用是评估肿瘤对治疗的反应。根据不同肿瘤的生物学作用，设置不同的参数，流式可检测多药耐药蛋白（MDR1）或者P－糖蛋白（PgP），它可将化疗药物泵出细胞并传递耐药性。由于流式可定量并进行多参数分析，它对MDR1的检测优于传统免疫组化染色和应用PCR技术检测MDR1的mRNA。一旦化疗药物进入细胞即会产生杀伤作用，主要是诱导凋亡，所以另一新兴领域是研究抗凋亡与化疗疗效之间的关系。BCL－2和P53蛋白是癌细胞凋亡的特征性分子，可用流式检测。P53在血液疾病的作用，主要是在DNA损伤的情况下（可为化疗药物所致）调控细胞周期与凋亡。BCL－2是基因家族（BAX和BCL－X）的一员，是另一个重要的凋亡调控点，可增强或减弱细胞对凋亡的敏感性。BCL－2可阻断化学治疗剂诱导的白血病细胞凋亡。Fas受体与Fas配体结合后，也可调控凋亡。应用流式多参数分析可以评估细胞凋亡的状态。5 d: B9 ~3 Z. s0 W5 h  |3 K
应用活细胞染料Hoechst 33342无需破膜可检测细胞凋亡。同时，可检测凋亡早期膜的特异性改变。磷脂酰丝氨酸改变可用Annexin V或者MC540检测。流式多参数分析可同时分析细胞周期和早期凋亡，因为Hoechst 33342和MC540是活细胞染料，所以分选后的细胞可做进一步研究。以上展示了流式多参数分析技术的应用前景。应用流式进行细胞分选为特定细胞群的分子学的研究提供可能，并为临床研究提供丰富的信息。
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cjsbaicai

谢谢，学习了