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- 积分
- 17
- 威望
- 17
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- 89
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准备工作：
8 k+ W1 W6 a. c5 n2 @DF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；
/ z! L/ l( T4 L# g/ V# x7 mDNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）$ F, A5 l! t0 c4 ~1 E# u2 Q
计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）
3 ]8 S @6 d* O. y" B1 C7 x
& b9 U# N3 _# o) ]染色方案：( ^% V; `+ \/ q/ z
① 细胞染色：$ K6 }9 y+ M9 |) K' b
细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；4 W5 ]8 U: C$ l; P% M
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；
: t9 F3 c( o. u6 i) J" t' Q/ R; j: D" y两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；. S1 X4 z, h8 `( _; a5 U6 Z
37℃避光水浴90 min；
, s4 Q! q9 ^. i/ D2 w; r冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I；2 e j- E% G% ]) [8 K3 V" z, c
上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞/ r& {3 o" k( m' ^, c& f; \- J
②流式细胞仪检测：7 b) s/ g/ U9 \# n
355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞." U& c8 N, k. Z' J+ q
% {3 D2 R8 l! u! [4 z) O( `5 k! V4 T* F+ [" {2 ^& H
goodell的sp分选
1 m9 _% L$ W/ r5 ~* U# @3 Nhttp://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：
. I6 |- b" f' c3 V Y; WHoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol w: X" c# d. S y* K( b
(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)
: O" h- Z6 s5 T8 ]5 h: J2 hThe ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst. h4 j( h+ \$ i) P: v
33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore,
* S1 O/ G4 i: T7 Ooptimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions. v$ ~- e5 P, ~+ y S2 a' G8 V
The Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL.+ T5 T( b8 \2 \
Likewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in& b$ X& F- w! ?) H- q
order to prohibit further dye efflux.
; s6 o3 V. K/ `! C' P3 C1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed/ m ~9 X8 i$ O) v/ {
beforehand.
( T7 ]; A' b- r* _! Z( j5 I% f8 z2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C, S( U" L" y$ \" n- x: L: r
water bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a) e' q1 `' q: g0 ]3 j) V+ u
centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 5
6 I& j! l4 q# X' \9 ominutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.
3 D, O. ~, O7 _, i* U9 T3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well.
- H4 Y# z. B; v8 M* p- X0 K I4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).
9 ? Z* D- q0 ^1 u3 H7 n5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make
9 w( W& H$ [$ \8 o$ n0 usure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the
+ Q' I9 V$ s1 R7 I1 G2 ntemperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several
/ l; Q" T% x4 C$ u, m4 Ztimes during incubation.
- S8 ? v1 F- d: x6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD
% e2 v/ D6 P7 ^ l$ |Phosphate Buffered Saline (PBS).
" A$ G& q% e( v- Z3 r* G7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the6 f2 U6 Z9 B3 J/ ?' W+ e
Hoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of7 M N5 P* Y4 Z* [, |2 v9 @1 w
the stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will- B$ F7 W+ _' H+ V0 u0 d
allow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only, Q2 D8 p& K2 l: n
cells that do not have an intact membrane.- x& @) A7 t9 ^
6 L7 |. B0 { i4 Q7 M0 u
% p( H3 B2 Z# P! C
4 z6 T' b/ U& T( A+ h! J这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。
) F$ B7 r/ S" D+ p1 d. v0 w一 Hoechst染色方案' F0 n; Q6 H. N0 z n' U4 H
1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。! r4 w3 ]# m5 S
2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。
. n g V6 J* _; m( F3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃ P# k8 H. z8 \2 X, j0 o# ^7 x. ]
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。1 o& B1 j @& X) m, l, }6 S
5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。: _* m! Z/ a, e# O; ]
6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。
7 d2 z5 [1 ` ^7 N' n; ?7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。" e u; X* H6 }. m3 _' q
8 试剂
7 n r9 L5 a7 [% ^DMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen)
6 b( \8 j5 j6 R7 KPenicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
: r q1 g& v' b; X10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)+ e0 `- x0 g. }2 h( v/ D6 G
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
; |" W! a9 I2 X u7 b1 k6 NHBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)3 T+ d9 i2 q" E" d6 Q
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
/ Q& V! z% f5 z6 w2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
5 j2 p2 R8 R$ E! O) Y9 z6 R( bHoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中 ，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。
/ e+ k- e6 \$ d% e! Z2 d' K5 |（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。4 S. l. S8 u+ O0 Y$ u+ q5 S% t; U3 ?
: U D8 \) @$ H2 o$ \" r二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案
2 @9 m; C- u- t' g+ A% H0 A１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml 冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）
6 E- y) T2 H; A3 P1 a/ `2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。
) K! ]: J, C7 |' b" L& W$ E: G9 j3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。
' _0 g* r; b! ~% M+ o$ O% ?( C4 I4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。
( n Y8 u" P s3 d5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。& z- A* ]+ p( H, R
三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析# \- J$ n: A0 T+ t' j. c
1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。% R# J; m! w/ Y% n# k
２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。
, | t2 t# e w/ a" x还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。6 c4 P2 s5 { F/ E% N& ^1 l5 |
3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。2 I* p: t. m: k
为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。+ I% g$ G/ b$ g- S% H% l5 O8 t
4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。3 ^/ V5 w- K( C+ L% p% z4 X
5 好的SP染色的证实
8 Z( K+ T6 u& N# B（1） 共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。/ Z, Q3 ?$ W/ m, B1 r7 ? T ^
（2） 用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。 |
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发表于 2009-3-20 10:44
发表于 2009-12-16 00:42
发表于 2012-7-5 23:33
