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准备工作：
) v! V& x* r5 dDF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；, d) i% N4 |8 t Y+ B
DNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）3 O2 n0 d [ y" p, G# _
计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）5 b; e4 O2 @9 k2 [' E
3 Q2 D/ v( b- q6 d
染色方案：
9 j5 W, i, [. B- Z {① 细胞染色：. s+ _+ w. a" H$ c
细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；+ `$ r8 Y y$ X" j2 N
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；
2 b! n% w) I. o- q; G }' D) o% r6 V两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；
' g( c: a7 t) W1 m; x& s/ D37℃避光水浴90 min；" u9 C, f! L3 @4 v8 J
冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I；
& M2 f2 J; P$ E. Q9 w上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞+ E- ]& F1 L1 | |+ [# ^( ^
②流式细胞仪检测：0 M8 R6 I0 w, E- I! J
355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞.
+ O; q( J% Q9 n
; Q) T: J% ~0 ]
' H! S1 [, f; Z/ }$ zgoodell的sp分选$ O2 s+ I7 w3 H, G
http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：
$ M; G, ]$ n) ~/ x; J- ?$ qHoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol$ U2 Z0 S: E" S6 q
(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)
. p$ \. D% g+ [* ~; l4 V- NThe ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst
3 y" ~: R3 `4 H1 C1 \* P33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore,
" b |; O. a- e" Y/ _4 T( a3 z. poptimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions.% x7 M, v% G4 Y& |/ y. n0 ]
The Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL.
! f$ h: I3 Z, U& y. {" r3 dLikewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in3 C; g( H4 `# D, _3 f" d4 z
order to prohibit further dye efflux.3 q* h X& D* f# U- c
1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed
. j1 T3 N4 g) @( q+ }. H: Rbeforehand.: a' G. {' z# D7 c
2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C
! j; k5 B0 r1 L. a& q& [ E7 T6 Jwater bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a- N; }3 \ }. Z
centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 5
% J. v6 M8 ^* @; q, @ G0 Uminutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.
/ g% x9 y% E+ b+ q6 k+ S6 r K3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well.
- a8 x5 x) v+ P4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).$ _ b% O/ S' a/ M w6 ~$ Z
5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make& ?! c- J6 G- q# ?' |/ u2 c
sure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the+ u9 ]# m3 M q8 y0 }1 b
temperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several; u5 t- _( u2 Z) a
times during incubation.
- Z. h) E1 y- E6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD3 @# v: h9 n a9 Q
Phosphate Buffered Saline (PBS).7 {! _2 J% G* q6 \
7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the/ f1 b2 T) p, y
Hoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of v1 F) A* H O, z- w# W, a" N; k
the stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will
4 j9 _! x. {# J" f- O& X$ |allow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only8 Z1 q4 U6 O7 ]3 W8 J
cells that do not have an intact membrane." _6 E* ^4 m/ y; I
% z9 ?/ H, i! n
) r6 ]5 O4 ^+ I6 \1 Q- [/ a# I! p9 y/ D$ {1 o4 k/ ]
这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。( D- B( d) O) ]- t
一 Hoechst染色方案' N: G3 r0 |) z& `( \9 W1 ~+ s
1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。1 R+ f8 t- z- Z& j' U& W( J
2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。. m" F9 z8 Y7 R% Y4 W$ e) P; D: X' V
3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃5 S5 F* G, m% O4 r8 t- f, ]; U# [
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。
: b0 N$ ^' i" h% X5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。
& {4 A4 U( J; E" F6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。
/ T A6 g* H7 ^7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。
6 D: X/ ^3 }- z' w3 ^& _8 试剂
- J: }; e! w. p" k0 LDMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen)
/ J+ j* r& P( I9 zPenicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
+ a& G- q6 Y1 H3 Q# f7 a* _10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)8 s# z0 u, M. q& x
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum7 X; `3 j1 c) \9 h# l9 ^ E( |
HBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)
# ~ p* _% |( J* x10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
6 N, m8 v }1 ]( z( W2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
2 ~' j& D: g# w; @, ~9 P5 D( _Hoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中 ，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。
8 {# T/ k( F# Z5 i& l（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。
6 G/ v0 |/ u2 d7 s
5 m7 s% a, }/ S% [9 P二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案# D2 n5 i" M* e4 q7 ?; h
１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml 冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）
4 |& {% w o$ A* l2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。
) R( X+ Q7 f$ s% m5 U, h* a1 _3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。
# l5 P( n1 e6 f5 g( w4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。
' l1 h0 f7 ?0 V6 ?5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。6 v4 V$ c o# @2 r) K9 _
三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析! @( I ~# j0 K+ v) l: k) B. M) v
1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。7 a8 j6 [# k+ W7 ~; ^# y" O
２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。1 h! q5 b ~( n0 v* z! A
还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。' p3 W' j0 m- Q# K* n
3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。
, H- P, ^( X7 T为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。8 x4 ^! j& W: c8 @$ F) C
4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。/ j6 ]4 g$ q0 x: Z) L$ E$ `7 `
5 好的SP染色的证实8 T) k, I" z) ]( A, _- F" o
（1） 共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。6 O% I; W" C4 l. _& p3 X
（2） 用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。 |
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发表于 2009-3-20 10:44
发表于 2009-12-16 00:42
发表于 2012-7-5 23:33
