|
- 积分
- 2
- 威望
- 2
- 包包
- 16
|
自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研
' \8 x! M! ]: O7 F& }2 V究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不" l3 V/ Z& V* V5 J0 p5 x
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
$ h$ \- L7 @. o7 X+ I$ I/ ^体带），不出带或出带很弱，等等。- F" ?% x$ A% ?1 o" \) _; S
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得4 M7 p- I0 Y0 z1 B$ X7 R# ]2 _7 x' ]
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR. g& ?4 S/ J8 b6 V! F! W
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件( O |( P$ F( L1 p: [5 C* z
使用问题进行探讨。& s9 b5 ?$ X/ ~- p' v% |
+ u( v0 s9 N, d* {
7 Z; t6 O. b4 I7 U1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
/ X0 n) j- V& b( c3 D DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
* h, u6 J$ t; c7 z
; e4 W. W0 [2 e/ y8 ]1 H; K 2.引物长度一般在15~30碱基之间。
8 U" Y3 c9 R/ [+ x3 z R( i: E: {! {+ p
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。0 | E. ]5 i% g" F1 z3 z) ~
3 _' e% W4 T9 I& x6 }# j) { i
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。/ Y- a! T8 D3 H8 h# |3 F( a
+ r7 x; D, c: Q+ h3 M2 m GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
3 B* x1 a" \ ~: @/ c8 z; f& M! I+ i3 j2 E8 k3 T+ J# ~
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
: Q5 l% \6 K' P+ X- Y
$ k5 h; e/ X6 A2 g# D. h 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。: f# i+ S f0 l, c
0 \7 [ C% \/ ^$ v3 k! T
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。) b" T! K7 Z8 a% b- [5 r
) G1 S" b, c2 I& r N3 A$ K2 |
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
0 ]5 C$ a$ u! }6 u: G6 `
2 o; V/ ^, W& ^. u! ~9 x 6.碱基要随机分布。7 }. R+ ?& }6 _) p' D6 a
2 L. D& A5 n4 Y0 r: H# Z3 V
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
9 l, l, d8 w9 X2 |* b
. J0 T) P/ X7 x2 O# i. A 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。6 d2 j2 F( ^- ]2 u" h% K
0 x! G9 ?4 F0 o+ p4 q
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
4 h. r) t% [1 P. S5 p$ N4 b+ ~# V* X A6 F- X5 ?. ?
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。4 P& ?, d$ q& h E* {0 a6 z
! F7 y7 l9 m; { e
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
& N; b+ ?$ |1 D* n- D6 G9 w- K' w7 t
8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。% n l! m! _: M# E& c
* }8 d) ?8 f$ x; h8 u U
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
& {! k* B1 p/ O! k3 Y, A5 k! l) H- c- ?) C2 b# z8 n; t; {; f0 p$ Y$ y
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 a2 O% g$ K5 R# S, R9 z3 ]
8 I7 h4 P8 c% R/ R( p; }- Z
引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
J/ E6 w2 ^4 j' }7 _3 a+ b* X! Z
r, C9 c8 D. h, | 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
3 R0 M# ?8 Z; I- M7 y
) V O' a8 ^; I( V 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。4 f4 D' b! b; `" F$ F0 Q
a) m5 ~6 g, [* B, |
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
& q0 p! x" c0 n
8 C# i7 K( w: T' }' \/ c 11.引物应具有特异性。
3 c& X6 ?3 [7 P6 v! e4 ]5 Y0 @( b9 B) @: `/ E
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
# s5 ~" A# C& J: ]5 n4 B% f# z# z, e I) H$ ], D* v9 ]
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。$ P3 a1 r" P0 h6 E2 g
' L8 ]& i; r1 N9 I$ K/ S& L
做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
/ Z5 U* O0 o& l' T) R
9 _3 W2 R0 {6 S; o/ d) p3 \ 1)避免重复碱基，尤其是G.0 M/ A5 y' R+ S# g2 P: [, c- o
@: L' `! w* @4 H X0 Y' g9 j1 N- ^ 2)Tm=58-60度。' _8 C. S4 s0 P: R6 f3 T/ l
; W' J6 z9 O5 w; k$ e 3）GC=30-80%.1 z9 T1 ~8 I4 {+ y/ w
( O6 G V; O B) l9 z9 o
4)3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
, m+ w% o- j9 z! E5 X% t% p0 p5 K3 P$ q& {! U/ y* o
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。8 X/ T9 s6 N X; X% e6 E
( u) `8 _4 T h6 D
6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。- ? o( T* E' k0 s
! W$ k- [5 ^3 c9 \& z 7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
3 C' J2 n% ?2 N; s4 s; J( o5 P* F% O6 I! W
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。8 ]0 t& i m8 [8 p' |) p- R
0 j. P" J7 R, C 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
/ e% I! U1 B$ a! O T1 ]. a8 i3 [0 M+ B, z$ U
至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。2 P1 X" }0 Y* g" E2 N4 ]$ ?
# C% u% N5 s5 O 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
$ V- i# N1 Q! u; l0 C% M) y! V U3 ?# i) h1 }
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。 |
-
总评分: 威望 + 2
包包 + 10
查看全部评分
|
发表于 2009-3-31 15:50
发表于 2009-6-13 13:07
