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发表于 2015-4-20 08:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞培养室的设置、设备和准备工作
一、细胞培养实验室的设置及设备
（一）细胞培养实验室的设置
组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。
细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 ) Y7 a" u3 T( `
1．无菌操作区
（1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。 % B7 A2 J! a% M$ g0 S8 b
理想的无菌操作室应划为三部分： 0 r3 w3 ]5 k( V/ z0 i7 v0 k
a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 8 y# i$ k8 X9 n: i
b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 5 _2 q6 |% i; b$ ]9 g; U- U
c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。
无菌操作间的空气消毒： . I% Z$ H- n  @8 i: L& G
紫外线灯—－产生臭氧，并且室内温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。 # Y5 u& d# v! G) B* I) X/ z9 o+ k7 J. U
空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。 6 _; ]- y9 [' }" i" C$ Q" O. n
表1 洁净室（区）空气洁净度级别表 $ e9 m/ Q7 Y) y  w4 o
洁净度级别尘粒最大允许数／立方米微生物最大允许数 * P" |! P" c- @4 Q  ?
≥0.5祄 ≥5祄浮游菌／立方米沉降菌／皿 ) n/ v* B3 l8 S5 g
100级 3,500 0 5 1 / I  C3 e9 }' l! Q) O, H, t
10000级 350,000 2,000 100 3 + ^# d% B8 {9 D1 Z4 Z1 g
100000级 3,500,000 20,000 500 10
300000级 10,350,000 60,000 － 15
无臭氧紫外线消毒器
电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的内外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。 1 G4 j, [: x7 L, a, z
（2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式 b)外流式或称水平层流式。 1 J0 n0 [+ z! o2 h6 l, G+ o% |  @
净化工作台工作原理（大致相同）—－通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。 ! b( ~, b' x" s8 H
侧流式工作台—－空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌。工作台结构为封闭式。 # v+ B6 e; `* w8 d5 H' E
外流式（水平式）工作台—－净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，但进行有害物质实验操作则对操作者不利。工作台结构为开放式（已少用）。   S1 q% M' J8 Y+ u: ~7 [8 X/ c
净化工作台应用注意： * Z0 S& B& ~6 p8 a
（1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。
（2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。 ; A8 y, N, ]5 b7 D; M! j
（3）使用净化工作台前，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射30～50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。 : b% x" d" F; t+ z2 f5 y0 r6 ~% ~
（4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。   p: l) Q- o# X2 A/ q8 C
（5）注意净化区内气流的变化，一旦感到气流变弱，如酒精灯火焰不动，加大电机电压仍未见情况改变则说明滤器已被阻塞，应及时更换。一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高过滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。粗过滤器中的过滤布（无纺布）应定期清洗更换，时间应根据工作环境洁净程度而定，通常间隔3-6个月进行一次。
（6）净化工作台使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。
（7）净化工作台应定期进行功能测试，检查净化工作台各项工作指标是否达到要求，例如进行无菌试验，定期检查台面空气的洁净度是否达标。 ) _6 h4 j. c- S: F: |
超净工作台的无菌程度检查超净工作台在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm平皿，在超净工作台内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将平皿半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30～35℃预培养48小时，证明无菌后将平板3个，以无菌方式带入超净工作台内左、中、右各放一个；打开平皿盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将平皿盖盖好，置30～35℃培养48小时，取出检查，100级清洁度要求：3个平皿上生长的菌落数平均不得超过1个。
超净工作台应定期请有关部门检查其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径≤5祄的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75~1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。
2．孵育区
本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。
3．制备区
在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。
4．储藏区
主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。
5．清洗和消毒灭菌区 ( R$ [- H* X: a& ], t0 i9 q7 T
清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。
(二)细胞培养实验室的设备
组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两大类：第一类为常用的基本设备；第二类为较高级的特殊设备。
1. 常用的基本设备 - [3 a" J1 w' i, d" u7 ?
（1）仪器： 6 w! A, G1 _" m5 n  u% I% [/ Z' J
a）显微镜：倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。 , Z; o& {$ Z6 p9 o+ J
——若有条件，尚可配置带有照相系统的高质量相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，以便随时观察、记录、摄影细胞生长情况。 : X' q' m6 a! Q$ }
a) 培养箱：体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，大多数情况下，最适温度是37℃，温差变化一般不应超过±0.5℃，细胞在温度升高2℃ 时，持续数小时即不能耐受，40℃以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱，如具有较高灵敏度的恒温培养箱及CO2培养箱。
恒温培养箱——应选隔水式或晶体管自控温培养箱，此类培养箱灵敏度高，温度控制较稳定。一般的恒温培养箱价格较便宜，其缺点是只宜于作密闭式培养。 $ u- N$ I, g1 D# a
CO2培养箱——目前多数的细胞培养室已广泛使用。CO2培养箱的优点是能够提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2（常用浓度为5％），易于使培养液的pH保持稳定，适用于开放或半开放培养。培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶；当使用培养瓶时，可将瓶盖略微旋松，使培养瓶内与外界保持通气状态。由于这种培养方法培养器皿内部与外界相通，培养箱内空气必须保持清洁，应定期以紫外线照射或酒精消毒。同时培养箱应放置盛有无菌蒸馏水的水槽，防止培养液蒸发，使箱内相对湿度始终保持为100％。
c) 干燥箱：用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，电热干燥箱升温较高，一般需达到160℃以上。通常使用鼓风式电热干燥箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始，至100℃时，停止鼓风，应避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而导致玻璃器皿损坏，应等候温度自然下降至100℃以下方可开门。 & A5 g2 v8 ^4 m4 h' o+ ?
d) 水纯化装置：细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。水纯化时可采用离子交换装置或蒸馏器。离子交换纯水尚不能有效去除有机物，因此用水时尚需再次蒸馏。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用二次以上蒸馏水。
目前国内使用较多的是自动双重纯水蒸馏器（石英管加热），使用方便，安全、蒸馏速度快（1600ml/h）。
使用注意： " K: X) h) f2 a
○a不可采用普通自来水蒸馏，以免蒸馏器内很快结成水垢影响蒸馏效果；同时，还需视蒸馏器内存水垢程度定期彻底清洗蒸馏器。
○b正确的使用方法是将经金属蒸馏器蒸馏的蒸馏水加入玻璃蒸馏器内进行再次蒸馏。 # [& C* `& v; F& Z9 {* @2 q: q" s
一般配制培养液的用水应在配液前蒸馏，不宜使用存放数日的三蒸水，以免影响培养用水的质量。 * q: s7 `+ e! z* Q& Z" h
目前市场上供应的是含有各种级别和类型的采用一种或多种纯化方法相结合的使普通水纯化为纯水和超纯水的纯水系统可供选择。例如：设计灵活的可以挂壁、也可为台式，也可以有储水箱、也可直接用分液枪的纯水装置；还可根据各类实验用水需求选择配备有效杀菌或去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，甚至可有效去除掉热源、内毒素的超滤型纯水器。
e) 冰箱：细胞培养室必须配备
○a普通冰箱或冷藏柜
——储存培养液、生理盐水、Hank’s液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。 . ?* A) |( i! ^+ m
○b低温冰箱（-20℃）、超低温冰箱
——用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。
——细胞培养室的冰箱应属专用，不得存放易挥发、易燃烧等对细胞有害的物质，且应保持清洁。 ) t' y* }* V9 N
f) 细胞冷冻储存器：储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小，取放使用方便及液氮挥发量（经济）三种因素。液氮容器的大小可自25L～500L，可以储存1ml的安瓿250～15000个左右。液氮温度可低达-196℃，使用时应防止冻伤。由于液氮不断挥发，应注意观察存留液氮情况，及时定期补充液氮，避免挥发过多而致细胞受损。
目前，国内各类实验室已广泛使用新型的细胞冷冻储存器。市场所提供的各种新型的细胞冷冻储存器具有性能优异，使用方便等特点。例如：
——可通过先进的电子控制器实现冻存自动化并监测液氮水平和样品温度，确保样品温度始终处于设定温度点；  $ @( O( n; w3 N. t* p, a: w
——可配备先进的报警系统，分别警报液氮液面、温度、电池、电压、电源等失常情况： # u$ I  o& h0 F# g! a
——同时具备热气体旁路系统，防止高于-130℃的暖空气进入液氮罐，从而更有效地保护样品，防止升温。
另外，多种规格的先进液氮运输，供应罐系列不仅移动方便，还可通过连接管给储存罐补充液氮，提高工作效率，保证样品安全。
g) 离心机：进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用离心机。 9 Z4 k" [6 p" s0 P  ?3 L% L( E
○a一般可常规配置4000rpm的国产台式离心机，例如细胞沉降，使用80～100g的离心机即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。 & a# g& \8 u* i( @7 E* ~
○b另外，可根据需要添置其他类型如大容量或可调节温度的离心机等
○c若需特殊用途，例如某些细胞的分离制备需梯度离心，则需另行配置实验所需的具备其他特殊功能的离心机。 & N, k2 L: D4 Y( ~2 f4 ^
h) 天平：常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。
分析天平的感量为0.1mg、0.01mg和0.001mg。根据称取物质的量和称量精度的要求，选择适宜级别的天平。要求精密称定时，当取样量大于100 mg 选用感量为0.1mg天平，在100－10 mg 选用感量为0.01mg 天平，小于10mg选用感量为0.001 mg天平。
i) 消毒器：直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。
常用：○a手提式高压蒸汽消毒器
○b目前市场上，具有高效、安全、方便等性能，适用于各种器皿、液体、培养基的高压灭菌装置已在流通（如脉动真空灭菌器）。可供使用者在灭菌的同时监测灭菌容器内的压力和温度，确保灭菌质量和安全，并可通过记忆（储存）支持系统改变各种参数（例如灭菌、排气、加热等参数），即使在进行灭菌时发生停电故障，仍可保留所设定的参数
j) 滤器：目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。 $ |, [* D' ]* Z7 B
目前常使用的滤器有Zeiss滤器、玻璃滤器和微孔滤器，各种滤器有其使用原理和特点（后详述）。
（2）培养用器皿：
a)培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。
（a）玻璃培养器皿的优点是多数细胞均可生长，易于清洗、消毒，可反复使用，并且透明而便于观察；缺点是易碎，清洗时费人力。 ! H; x) x  J, @. d; a9 {
（b）塑料制培养器皿的优点是一次性使用，厂家已消毒灭菌密封包装，打开即可用于细胞培养操作。 & W1 T$ U# |$ n+ m3 p8 t
常用的培养器皿：   R6 _/ h1 V0 S: Z" l0 ~
培养瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；进口培养瓶则多以底面积（cm2）表示。 + l) Q+ E1 V. c& F- I
培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。 " N. P1 r  C- A) C2 @6 F
多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。
各种单层生长的细胞在培养器皿中长满时可获得的细胞数，主要是取决于器皿的底表面积和细胞体积的大小。常用培养器皿及可获得的细胞数（以Hela细胞为例）见表2。 * H- f# |7 h- f/ A! P, e2 U( d( ]
表2 常用的培养器皿及可获得的细胞数
培养器皿底面（cm2）加培养液量（ml）可获细胞量
96孔培养板 0.32 0.1 105 & ~- {* g1 r4 @% ?/ O4 \9 u
24孔培养板 2 1.0 5×105 % ^4 ]+ B" T0 {  t+ K4 E  A
12孔培养板 4.5 2.0 106
6孔培养板 9.6 2.5 2.5×106
4孔培养板 28 5.0 7×106 - T5 v6 s9 _: I& Y! ]
3.5cm培养皿 8 3.0 2.0×106
6 cm培养皿 21 5.0 5.2×106 0 r8 Q& T3 W( u, j8 L6 T
9 cm培养皿 49 10.0 12.2×106
10 cm培养皿 55 10.0 13.7×106
25cm塑料培养瓶 25 5.0 5×106   ^/ l/ ^: C! d3 ^5 _/ {
75 cm塑料培养瓶 75 15～30 2×107 " R6 S0 L' O! \0 w# Q6 x- }
25 ml玻璃培养瓶 19 4.0 3×106
100 ml玻璃培养瓶 37.5 10.0 6×106
250 ml玻璃培养瓶 78 15.0 7×107
2500 ml旋转培养瓶 700 100～250 2.0×108
b)培养操作有关的器皿：
○a贮液瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。
○b吸管：主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可以作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。 6 u1 x. b1 P" V' D0 F+ A9 U
○c加样器（移液器）：用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。尤以微量加样器，可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。目前，可高温消毒的，多通道的各类移液器可供使用者选择，能确保加样准确、快速、方便并且达到无菌要求。
c)其他用品：尚有收集细胞用的离心管，放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡胶吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗，超净工作台使用的酒精灯，供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。
（3）器械：主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有：手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪（弯剪及直剪），用于解剖动物、分离及切剪组织，制备原代培养的材料；眼科虹膜小剪（弯剪或直剪），用于将组织材料剪成小块；血管钳及组织镊、眼科镊（弯、直），用于持取无菌物品（如小盖玻片）夹持组织等；口腔科探针或代用品，用以放置原代培养之组织小块。
2、特殊设备
细胞培养实验室除了应配备上述的常用基本设备以外，如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，以便更有效、更精确、更深入地进行实验室工作。例如： - a) m9 J$ o3 T- m
（1）酶联免疫检测仪——可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等。
（2）超低温冰箱（-85℃）——便于储存某些试剂及标本。
（3）旋转培养器——用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养。
（4）荧光显微镜——进行荧光染色样本的观察。
（5）流式细胞仪——可更精确及快速检测细胞。 ) o4 a( T2 K3 L
（6）用于检测细胞培养条件的各种仪器，例如专门为快速分析细胞培养基中主要或关键营养成分、代谢产物及气体含量设计的多功能细胞培养分析仪、手提式CO2浓度测定仪等。
二、培养用品的清洗和消毒灭菌
组织培养工作需要使用大量的器材，特别是玻璃器皿。在组织培养工作中清洗和消毒灭菌仍是一项繁重而艰苦的工作，其主要目的是去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。
（一）培养用品的清洗
1．清洗：在组织培养中，细胞对任何有害物质都十分敏感，因此对新的或用过的培养器皿均需严格清洗。组织培养器皿清洗的要求比普通实验用器皿更为严格，每次实验后器皿都必须及时、彻底清洗，不同的器皿清洗方法和程序也有所不同，必须进行分别、分类处理。 # `, s# J0 y) J- {
（1）玻璃器皿：玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洁干净，而且要带适当电荷。苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。清洗玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，且不能残留任何毒性物质。为了保证清洗的质量，一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤（以玻璃培养瓶或培养皿为例）。 3 F6 |/ c1 q9 e* }* J8 L
a)浸泡：新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜，以中和其碱性物质。使用后的玻璃器皿应立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸后黏附于玻璃上难以清洗。泡时应将器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。
b)刷洗：经浸泡后的玻璃器皿尚需刷洗。一般多用毛刷和洗涤剂或洗衣粉进行洗涤，以去除器皿内外表面的杂质。刷洗时有两点需注意：一是防止损坏器皿表面光洁度以免影响细胞生长，所以应选择软毛毛刷和优质的洗涤剂，刷洗时不宜用力过猛；二是不能留有死角，要特别注意瓶角等部位的洗涤。刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净，晾干。 8 l: ]: L0 Y# E. Q0 F9 L8 Q/ u( p
c)清洁液浸泡：清洁液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成。具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可被完全清除。
清洁液可配制成三种不同的强度，其成分用量见表3。 " Q- W3 W/ B4 d8 Y7 T! ]8 ]
表3 清洁液配制
弱液次强液强液 6 I- C/ J  ^" q+ [$ Y7 Z
重铬酸钾（g） 100 120 63 ( \; ~6 G# \( I5 u" L
浓硫酸（ml） 100 200 1000 . R/ A6 l( B, D4 @9 @& E# |
蒸馏水（ml） 1000 1000 200 ( E* q: m  ?1 j3 Y# T) d7 l
细胞培养物品清洗所需配制的清洁液强度通常为次强液。新配制的清洁液呈棕红色，经多次使用、水分增多或遇有机溶剂时为绿色，此时表示清洁液已失效，应废弃而重新配制。 8 T* r5 W& L# w5 M
清洁液本身具有强腐蚀作用（玻璃除外），因此在配制及使用时应注意安全。配制时注意保护身体裸露部分及面部的防护，应使用耐酸手套、耐酸围裙，防止皮肤损伤及烧坏衣服。配制过程中，应先将重铬酸钾完全溶解于蒸馏水中（必要时可加热帮助溶解），然后缓慢加入浓硫酸。由于加入浓硫酸时将产生热量，因此配制的容器宜用陶瓷或塑料器皿，同时注意散热、降温，防止容器破裂，发生危险。清洁液配制完毕浸泡器皿时，同样要注意防止灼伤，应轻轻将器皿浸入。浸泡时，应使器皿内部完全充满清洁液，不留气泡，一般浸泡过夜，或至少6h以上。 - F6 z: z5 k) L4 V0 a$ |
d)冲洗：玻璃器皿经浸泡后，第一步，使用流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，须重复十次以上，直至清洁液全部冲洗干净，不留任何痕迹为止。然后，再用蒸馏水漂洗2～3次，最后用三蒸水漂洗一次。烤箱内烘干备用。
（2）玻璃滤器：玻璃滤器以烧结玻璃为滤板，固定在一玻璃漏斗上。主要用于各种培养用液的过滤除菌，不宜单独过滤血清等粘稠液体，因容易堵塞滤板小孔。此种滤器只能连接真空泵在负压条件下抽滤，不能施加正压。玻璃滤器使用的清洗工作十分复杂，整个清洗过程约需一周，目前已很少使用。其清洗具体方法简单介绍如下。 7 m# `* f* M' h$ k1 ~
a) 自来水漂洗：用洗衣粉擦洗（不得使用毛刷），自来水漂洗，滴滤过夜。 0 F3 P* k7 k5 |6 {
b) 自来水抽滤3～5遍至无白沫，自来水滴滤过液。 6 L: r, \, m; _0 [  L
c) 清洁液抽滤一遍，清洁液滴滤过夜。
d) 自来水漂洗抽滤5遍，自来水滴滤过夜。
e) 蒸馏水抽滤3遍，蒸馏水滴滤过夜。
f) 三蒸水抽滤2遍，三蒸水滴滤过夜，漂洗。
g) 烤干备用。
（3）胶塞、盖子等杂物：组织培养液中使用的胶塞、培养瓶盖子、针头等均不能以清洁液浸泡。清洗过程中，新的胶塞因带有滑石粉，应先用自来水冲洗干净，再进行常规清洗；使用后的胶塞、盖子应及时浸泡在清水中。然后用洗涤剂刷洗。针头需用自来水冲洗干净后置入2％NaOH中煮沸10～20min，冲洗干净；再以1％稀盐酸浸泡30min，冲洗；用蒸馏水漂洗2～3次，最后用三蒸水漂洗1次。晾干备用。 & w* z4 }4 V$ r, m# X
（4）塑料器皿：组织培养常用的塑料器皿包括各种培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要为进口的一次性物品，供应商提供给用户时已消毒灭菌并密封包装，打开包装即可使用。由于各种原因，部分实验室尚未能做到将这类物品完全作一次性使用，仍需经过清洗和消毒灭菌后反复使用。我们的清洗方法通常是：用后立即以流水冲洗干净或浸入水中，防止干涸。超声波清洗机内加入少量洗涤剂清洗30min，流水彻底冲洗干净，清洁液浸泡过夜，流水彻底将残留清洁液冲洗干净，蒸馏水漂洗2～3次，三蒸水漂洗2次，晾干备用。亦可采用下述步骤：器皿经冲洗干净后，晾干，2％NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5％盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗，蒸馏水漂洗。但不宜反复使用次数太多。
2．包装：组织培养的器皿需清洗、晾干。在消毒前必须进行包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。一般用皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作为包装材料，对培养瓶、滤器、存放培养液用贮液瓶、吸管和胶塞（或培养瓶盖子）等物品的容器瓶口部分做局部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备用。对体积小的培养皿、移液器吸头等可以全封闭包装。注射器、金属器械可直接装入铝制饭盒或不锈钢等容器内。重复使用的培养板则用优质塑料纸严密封口。
（二）培养用品的消毒灭菌
造成组织细胞培养失败主要原因之一是发生污染，特别是微生物的污染。组织细胞培养中所使用的各种培养基，对细胞来说是体外培养必不可少的，同时，对微生物也是最合适的营养物。若有微生物污染，微生物可比细胞生长更迅速，并可产生毒素影响细胞的生长甚至使其死亡。因此，在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。本节重点叙述消毒灭菌的方法，无菌操作技术在下一课中讨论。 3 A7 e4 x: b' O2 D8 S
1. 消毒灭菌的方法：
根据材料的要求可采用不同的消毒灭菌方法。总的说来有物理方法及化学方法两大类。物理方法包括用湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。以下重点介绍组织细胞培养常规工作常用的几种消毒方法：
（1）干热消毒：一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要用较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，需加温到160℃，保持90～120min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。
（2）湿热消毒：湿热消毒是一种有效的消毒方法,一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。为了保证消毒的效果，消毒物品不应装得太满，以便消毒器内气体流通；导气管要伸至罐底并防止堵塞，在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。冷空气排出后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。高压消毒可在5、10、15、20磅的压力下进行，持续时间可为10、15、20、30min。根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是15磅20min，一些常规使用的液体的消毒要求为15磅15min，橡胶用品为10磅10min。一般认为在这种情况下于1min内几乎可杀死所有微生物，但由于在消毒物品的包装内可能仍有冷空气未全部排出或蒸汽尚未能达到消毒器内的各部分，所以要延长消毒时间。消毒完毕后一定要先打开阀门放气，再打开消毒器的盖，以免发生意外。 . C' B: k/ W4 {
煮沸消毒可用于注射及某些用具的快速消毒，缺点是湿度太大。
（3）紫外线消毒：紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。但在房间内安装不能高于2.5m。要使各处达到0.06μw/cm2的能量照射，否则影响消毒效果。也可以用紫外线消毒一些塑料培养器皿（如塑料培养皿、塑料培养板等）。缺点是消毒有死角。现已有电子灭菌灯可以代替紫外线灯进行实验室的空气消毒。 , S! H# Z2 x7 n7 o  u
（4）过滤除菌消毒：有很多组织细胞培养使用的液体不能采用高压消毒的方法进行灭菌处理，如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等，可采用过滤方法以去除细菌等微生物。滤器有抽吸（抽滤）式及加压式两种类型；滤板（或滤膜）结构可为石棉板、玻璃或微孔膜。常用的滤器有以下几种。 , i2 S7 F9 Y1 g, R/ g
a）Zeiss滤器：这种滤器为不锈钢的金属结构，中间夹有一层石棉制成的一次性纤维滤板。滤板具有一定的厚度，可承受一定的压力，因此是过滤血清等粘稠液体较理想的滤器。滤板有不同规格，进口的型号EKS1、EKS2、EKS3等，国产的有甲1、甲2、甲3等。其中以EKS3及甲3过滤除菌的效果较好，但因孔径很小，速度较慢，目前多数实验室已经很少使用。 1 ?1 g  d6 x9 b" y
滤器可分为抽滤式或加压式。抽滤式滤器与抽滤瓶相连，真空泵抽气形成负压以过滤液体，其效率较差。由于抽气造成负压抽吸，操作使用时要防止倒流而引起污染。因此要注意：避免将出、入管道接错；停止抽气时应使气体缓慢回流，要先用止血钳夹住抽气管再关机，防止气体回流。加压式滤器的容器为密闭式，加入待过滤的液体后，通以气体（常用N2、O2或CO2）形成压力将液体滤过，效果较佳。使用时注意压力不能过大，不应超过0.2kg/cm2。另外，由于使用的滤板为石棉，滤过的液体内有时可能混有少许杂质，因此在过滤前应先以少量生理盐水湿润滤板。 0 P% C* _" Q0 A$ R6 _% Z5 d
Zeiss滤器的清洗较玻璃滤器简单，滤板属一次性，使用后即可弃去，以自来水将金属滤器初步冲洗，洗涤剂刷洗干净，自来水冲净，蒸馏水漂洗2～3次。最后二蒸水漂洗1次，晾干包装。消毒前将滤板装好。旋钮不要拧得太紧；消毒后立即将旋钮拧紧以保证过滤除菌的效果。 ; j* f4 ^2 \- @! Z# G
b）玻璃滤器：这种滤器为玻璃结构，以烧结玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上。可用于过滤除血清等粘稠液体以外的各种培养液体。只能采用抽滤式。根据滤板孔径的大小，分G1~G6六种规格型号，其中只有G5及G6可用以滤过除菌，一般都使用G6型。其缺点是速度较慢。
玻璃滤器的使用方法与抽滤式Zeiss滤器相同。 ) P! d, N' D+ a" p' N
c) 微孔滤膜滤器：这种滤器的基本结构与Zeiss滤器相同，为金属结构，但其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂滤膜。可用于包括血清在内的各种培养液的过滤除菌，速度较快，效果较好，现已为许多实验室所使用。滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大小而划分其型号，可按待滤过的液体的量来选择适当的型号。实验室滤过较大量培养液多用直径10cm(容器量为500ml)及直径15cm(容器量为2000ml)两种规格。用于小量培养液时，可选用2.5cm直径滤器，以注射器推动为压力而滤过。 % A$ ^4 F, @9 _% s, z& Y* Y+ V
微孔滤膜滤器可为加压式（正压式）或抽滤式，由于加压式微孔滤膜滤器过滤效果好、使用方便、易清洗，目前使用最为广泛。
滤膜的选择是效果好坏的关键。常用的滤膜孔径为0.6祄、0.45祄、0.22祄。用于滤过除菌时，通常使用0.22祄孔径的滤膜（可有效除去细菌）。由于滤膜较薄且光滑、易移动，滤器的上层和下层的相应部位各设有一凹槽以放置一硅胶垫圈便于固定滤膜。安装滤膜时应注意正确放置；同时应注意滤膜的正反面（正面即光面应向上）。由于滤膜承受压力有限，滤器不应安装过紧，以免造成滤膜破裂。实验室在过滤大量液体时通常使用两层滤膜，上层为0.45 祄，下层为0.22祄，以确保过滤安全。每次过滤完毕应核实滤膜是否移动或破裂。 8 k, Z5 v( a6 B) p" A+ M
微孔滤膜滤器的清洗、消毒方法和Zeiss滤器相同，滤膜使用后即丢弃。 7 @; c4 l) h' H
目前市场已供应各种一次性滤器，可根据实验需要进行选择，例如，可连接在加压蠕动泵上的过滤较多液体的滤器，可直接连接在注射器上过滤较少量液体的针头式滤器、可用于过滤微量液体的微型滤器等。
（5）消毒剂及抗菌素：组织细胞培养工作中也可利用消毒剂来进行灭菌处理，消毒剂主要是75％酒精、过氧乙酸、乳酸等化学制剂。可分别用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面，实验室的桌、椅、墙壁、地面及空气等的处理。如75％酒精最为常用，用途也最广泛；0.1％新洁尔灭可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒；另外尚有各种用于地面消毒的消毒液（例如三花消毒液、过氧乙酸等）可供选用。 $ J, J' O; |  H. X* C$ Z* g. ?
抗菌素也常在组织细胞培养中使用，但多数是为了预防。要注意的是不能完全依赖抗菌素来达到消毒灭菌。常用的抗菌素为青霉素和链霉素。 & b  ]- E9 y& c  |5 B/ {7 T
（6）其他方法：
a) 电子消毒器消毒灭菌：使用市售的电子灭菌器可消毒不宜高热灭菌的器皿及用物，例如塑料制品等，消毒时间通常为30min，消毒完毕应及时关闭消毒物品容器。
b) 辐射灭菌：通常采用放射性60Co照射需灭菌的各种不宜高热灭菌的器皿及用具以及部分实验用药物、制剂等。
2．消毒方法的选择
组织细胞培养工作中的消毒灭菌方法如上面所述可有多种，应根据具体情况选择应用适当的方法。 # ]! E! x! [' d1 U! ^5 g( k
实验室环境的消毒：实验室中空气的消毒，最理想是采用过滤系统与恒温设备结合使用，但价格较昂贵。亦可用紫外线消毒，但安置紫外线灯时要符合要求，且在工作期间不宜在开启的紫外灯下操作。另外尚可用乳酸等蒸汽或电子灭菌灯消毒。实验室的地面多用山花消毒液等消毒液或新洁尔灭溶液等处理。桌椅等亦多用消毒剂消毒处理，最常用的是以酒精擦拭，亦可用紫外线照射。 # K# G5 r0 P7 a( J
培养器械的消毒：多数培养用的器材常用干热或湿热消毒。干热消毒的方法最为简便，凡高温不致损坏的器具如玻璃器皿等，可以干热消毒。湿热时的蒸汽能较快穿透，热传导较佳，故比干热更有效，对于干热高温会损坏的器材，可采用湿热消毒，如有些器械、液体、橡胶制品、布料等常用高压蒸汽灭菌。有些器械可煮沸消毒，或以消毒剂浸泡；不能耐高温的塑料制品，可用消毒剂浸泡或紫外线照射。
培养用液体的消毒：盐溶液及一些不会因高温破坏其成分的溶液，常采用高压蒸汽消毒。血浆、血清等生物性的天然培养基，不能以高压蒸汽消毒，必须用过滤方法除菌，但因较粘稠而不易进行；合成液体培养基则采用过滤的方法除菌。

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