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目 录# [! q9 S& l: g. i2 r5 g3 L
转染选择指南和转染决策树 . . . . . . iiii o' V# l: A/ a% `0 y
1. 简介 . . 1
* j7 b5 i6 _2 `* Q. W" L; V0 ~2. 转染基础知识 . . 21 M% T, I% K$ @* h" k- S% P# |: {1 }& I
转染介绍 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
. }4 T, G5 L. W: M5 G什么是转染 28 V. F6 ]( w$ g/ s
术语 2 Y- `" o) ~. [" S
应用 3
$ G: K S6 V7 P转染类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
, L5 M9 [) l$ X瞬时转染 41 K4 G$ x# F K; U! u
稳定转染 4$ v! C* D! [, c2 G
选择转染策略 . 51 k) H" g8 E. a3 _0 P
基因输送技术 . . 79 Q) g3 \$ B8 w4 m0 m
阳离子脂质体介导的输送 95 ?8 F" ?$ n# L
磷酸钙共沉淀 10( w. V2 L# b+ e7 P- t. Y& g `
DEAE-右旋糖酐介导的输送 . 11
) }3 @' \, V& Q) _其他阳离子聚合物输送 . 12
1 V! |# z) s# b8 Y% W/ U3 L4 g病毒输送 132 |* j' X; h6 a0 y4 _( U# S2 a
电穿孔 . 14# }% {* q9 _) M; A: i0 ]! w
其它物理输送方法 . 15' R+ `2 R6 t) B
阳离子脂质体介导的转染 . . . . . . . . . . . . . . 16
) T* y X6 g! {9 q2 L机理 16
5 A* }1 a* g; e! K阳离子脂质体转染试剂 . 17
4 F* q* x' v- Q* W4 [) W! ]病毒介导的基因转移 . . . . . . . . . . . . . . . 19# ^$ Q. w4 ~3 N4 p; |
病毒载体的主要特点 . 19: f. M2 b" `# o
常用病毒载体 19
$ F. i1 g" k2 X: e% nNeon®转染系统 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21& ]+ H* e2 \& A: x% Q
稳定转染子的选择 . . 23/ S m7 G( C9 O/ N" b
用于真核细胞的选择性抗生素 . 23
z8 ]5 r; Y8 J/ q报告基因分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
0 `) B9 z- J" ]$ n' I转染分析 24' E! Z# y/ _: x! D) G
基因调控分析 25
# Z, w3 V2 Z/ \( U) V" ]常用的报告基因 259 |7 b. \) Z2 B/ o, b) y' H" E
RNAi和非编码RNA研究 . . 26( D) C$ Q# t# Y$ `) r* e' D
常用RNAi术语表 . 26/ V& _" o6 D0 R$ d' R9 O0 g
RNAi工作原理 . 27% G5 F C! ~3 A- u
siRNA分析 . 27
' b) Z; g/ Z# ]! f$ B$ lmiRNA分析 28
( i, V. D$ _; Y$ l选择RNAi方法 . 29" z) U4 r; i, O) y% ^! I
3. 转染方法 . . . . . . . . . . . . . . 30
0 U: z! R. h8 ]0 L+ }影响转染效率的因素 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30# i4 J; u; p" u! x
细胞类型 30
3 ^" ^6 `# s, c; W. T2 K! J( Z. E Q细胞健康与活性 31
/ {; d4 L2 c& z% ]汇合 . 327 n0 ?; a3 k& G- g1 n7 t' @
培养基 . 32 v L' L" D/ k0 i# E. M
血清 . 32- M3 x# g) U J% ]+ v
抗生素 33) ?& l1 y5 l. L4 T- N* q
转染分子的类型 33
- F$ n' b2 B( G( H4 w转染方法 337 g8 d7 E; W6 w6 J) M5 ^$ \
选择转染方法(非病毒) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
0 g0 o% G; J* \* w8 L连续细胞系 . 34
$ ~ n9 ?8 G- P原代细胞和有限培养物 . 357 T! m/ {9 V% O l- }6 D
选择病毒DNA输送系统 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36$ n7 ]4 J ? R* ~
哺乳动物细胞表达系统 . 36
. n% L. M' @# j- x昆虫细胞表达系统 . 37. Z d. K9 B" o8 P5 C/ c8 P R
质粒DNA转染指导原则 . . 38* z* A: i/ Z4 }( }7 ^3 n
载体考虑因素 38
. Z! f* N' ?7 r# |" C+ @) j9 x) b质粒DNA的质量 38
* B+ o' F- p9 l! X$ x基因产物和启动子 . 39
3 Z( e6 [0 y7 g( `' {对照 39
$ \% X9 y8 t) k1 w6 _/ s质粒DNA转染的优化 . . 39$ s+ V* l; y% t+ p% O( _
磷酸钙共沉淀的考虑因素 . 40
: n5 V2 ~, \" ~" J/ ~7 S阳离子脂质体介导的转染考虑因素 41$ E( ^. C% `2 p9 E3 O1 u
电穿孔的考虑因素 . 43; E% C8 z2 U t. n6 o
稳定转染子的选择 . . 44' z3 }9 g$ U6 ]
开始前 44
7 H* a* X7 f, @. P+ w杀死曲线 44/ ]/ P- D- Q0 W5 L
选择工作流程 44) L4 F( K/ d( J7 X$ ^& ?! C8 c
选择RNAi策略 . . 46
8 r; A2 ^1 _% g7 n; NsiRNA与载体方法 46
$ H9 H% A# O1 E非载体siRNA技术 470 i" P! a2 s2 Q; O' |& E
siRNA转染 . 49
L# k" i4 v) c! b% M. e# E# ]载体介导的RNAi . 50
& R0 a1 R. V+ J" x! U! l9 HRNA转染指导原则 . . 513 i, f( j/ S7 a( t# i! W
RNAi工作流程 . 519 ~' Z9 `: X% r. @3 m+ z
RNA处理 52
/ O3 [$ t, L M& w5 R3 n% l, U( s转染效率 526 d0 m* b# i2 J! J6 C
阳性对照 . 52! j4 q" p' G0 ^; ]5 N- T
阴性对照 52$ O% m& x7 t A* q8 ]4 H
共转染 53
7 r) S2 Z6 `* e4 o$ h$ vsiRNA质量 . 53% l2 i6 t" x$ ?' g! d
siRNA用量 . 54
7 V" ?; r0 {" m( ?! P7 p转染试剂的体积 54
) A0 u+ H" G5 A/ }细胞密度 54
6 h% c" }3 `/ [; C暴露在转染试剂/siRNA复合物中 . 54* G3 a. r- m& D* T; b
转染过程中存在血清 . 55# i" u; `1 f% s$ g
siRNA实验成功的技巧 55! u, @5 `; j4 V9 g6 f+ O |4 ^8 t
siRNA转染优化 . . . . . . . . . . . 56; n+ l! Y) G% Z% t5 s8 O6 j
影响siRNA效率的因素 56
) W1 T3 L/ a' ^( P2 Y z8 |附录 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 574 H4 G7 u% }5 R0 c' R7 b0 X
转染产品列表 . . 57 n. [7 t8 I) j- L
转染试剂 57
! |- r. H" d6 z% D7 e1 ^: w2 R/ \' Z: pNeon®转染系统 . 58
5 c& [7 V9 x/ ~, D T& B- ?RNA干扰 58
0 z d. r# |1 U3 H3 X参考文献 . . . 59
5 y6 v/ \: m$ q# S% j9 j6 l |
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发表于 2015-7-9 09:28
