CIK细胞鲎试验（内毒素）检测

fsj1987

大家hi起来讨论一下鲎试验吧！自己提高也能服务新人

fsj1987

我先来踩点/ \) E8 z) Q: F( ?
1、实验室物品准的准备
: n' ~) o. Z+ c# n( S5 |' q1.1        涡旋混匀器。
; j) ^1 f- J) p0 p0 ~1.2        恒温水浴锅。4 {) }6 d, f: `; ]# }2 Q
1.3        鲎试剂（TAL）。
7 L* r/ `4 k0 j. I1.4        细菌内毒素工作品（CSE）。
- D% B7 h, L5 [) ~+ U1.5        细菌内毒素检查用水（BET），内毒素含量<0.015EU/ml。- c. o" L9 Y! q" A: o; v
1.6        无热原试管。
5 J* d% V. Q3 p. Z5 J6 y1.7        无热原吸头（200ul，1000ul）。. d1 i- r& S/ G- `
2、内毒素标准工作品溶液的配置
0 _  p/ C* L/ `3 _4 y2.1内毒素标准品溶液的配置7 B' y8 e. M* [& ^3 K6 \
取细菌内毒素标准品1支，用酒精棉球消毒瓶颈，开启加检查用水1.0ml并混合15min备用。2 G, t5 g5 i' g) j2 p# P
内毒素标准品为10EU/支，鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml时，内毒素阳性对照稀释至2λ，即0.25EU/ml。（注：横线上方表示取浓内毒素溶液的量，横线下方表示加检查用水的量。）
3 B3 `" W+ l0 h$ Q3 b+ {) d10EU/ml    1.0EU/ml     0.50EU/ml     0.25EU/ml6 ^7 D, Z% E; U. {' m
2.2 供试品溶液的制备
+ g: u7 q# U* K4 I6 d- u1 r. p7 Q7 t有效稀释倍数（MVD），按下公式计算：% R3 \: C1 F; K) T8 N* ?
MVD=cl/λ' ^) }% B- h% D# S) K6 R
式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。
8 Z5 s( B3 I2 {- G) |4 x  P如，细胞悬液其内毒素限值为2.0EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
2 Q0 W' E# M9 @  {5 SMVD=cL/λ=1×2.0/0.125=16（倍）& w- H/ Q7 u- U. }! `
取供试品0.125ml加检查用水1.875ml，混合均匀做内毒素检查用。1 i5 n/ a5 A' c, n# M. j# H4 I
2.3 供试品阳性对照液的制备% |( k: c$ G' `4 i* p+ l
分别取供试品的8倍稀释液0.5ml和0.50EU/ml的内毒素溶液0.5ml，混合均匀供检查用。2 I' b* ]0 ?0 E
2.4 鲎试剂的准备( v3 I2 x2 s) w0 l  P, G, q
根据供试品的数量，取鲎试剂0.1ml/支若干，按标示量加入检查用水复溶备用。
# N8 j) Y* b! L& r/ K试验加样见下表1。
* U* J( W! D9 S% [) b/ j表1供试品内毒素检查加样方法
7 x( ?8 G1 e' r9 I% [7 }4 d6 @8 t; o5 I7 a' }# S
4 J5 I$ p% u$ U+ O, N3 k
测试组（A）        阴性对照        供阳组（B）        阳性对照1 P: W( L% ~4 ~. W! W1 T. m3 D& X
        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号,2号
' C" U9 j: a& R" h/ W: ]+ h" n  [鲎试剂溶液        0.1        0.1        0.1        0.1
0 u5 {6 w  T4 Y3 C  F标本液        0.1                       
- @# _- `; i. c2 i$ q4 s检查用水                0.1                : }9 ^6 l7 r/ Y! a6 f, b" x/ q3 t
供阳性液                        0.1       
0 U7 @1 n6 ~. u, m: q& S% s阳性对照液                                0.1
( W$ {5 J) `% ^7 ?# X$ a$ |2.5 检测
1 j4 ?8 O' s) m" H% w' w加样完毕，将试管中溶液轻轻混匀后，转移至试管内，用封口膜密封管口，垂直放入37℃恒温水浴锅中，保温（60±2）min观察结果。6 c  L2 L) ^; w! s" C8 v/ A
判读，时间截止将试管从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（结果判读，当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方有效）。/ g) B0 A* S/ b

fsj1987

今天做的内毒素阳性滑落，然后第二次做就没事，不知什么原因？你们都遇到过吗？

teahouse0802

我们在实际的细胞培养过程中也会出现假阳性的情况，一般出现假阳性之后都会做平行复检。我们的内毒素检测鲎试剂是不加检测用水的，直接向鲎试剂管中加入200微升待检样品，这可能和选用的鲎试剂品牌不同有关系。
" l5 H+ J+ c  Y* c1 W/ B+ ^" t1 l4根管两根原来浓度，两根稀释8倍的，如果复检结果为4根管都为阴性，则判定之前的结果是假阳性。
4 k' }) ~; s; [) t如果复检结果未稀释的出现阳性，稀释8倍的表现阴性，而我们的内毒素限值是1.0，而鲎试剂的灵敏度为0.125，所以也判定为阴性。
1 K9 _% ]+ [7 d5 M( a( y如果4根复检管都是阳性则，则表示这份细胞不合格。

teahouse0802

回复 teahouse0802 的帖子, F' Q0 ?) F* n1 m5 ]* ~% h1 W
3 U) P' _8 d) t" i: b
补充一下，同种浓度出现相同的检测结果才算做有效。

colins

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) l0 y+ R, a  U/ ?+ M' E
% v2 a" ?: \% q$ ?6 p如果只是阳性管滑落的话，应该是你操作的时候动作幅度太大了，如果是干扰组滑落的话就应该检查你的干扰试验是不是做的合格。我偶尔碰到一些该凝胶的未凝的情况，结果复检都没事了，如果经常碰到的话就应该加强一下操作了。: L3 _& M0 y- B
我觉得细胞类产品很难出现内毒素不合格，所以应该加强操作的熟练程度，我们把内毒素限值定在了0.5，很久都没见到阳性了

yingfeixiang

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% j9 o, d0 _/ D/ W7 M$ V7 y! h) z) Y  I+ p3 i: w* [$ S$ ~0 P. l
是凝固状态后滑落的话，就是拿起看的时候剧烈碰撞了，我就又一次

baby00000003

有些个可以不通过凝胶滑落测量内毒素限度的机器
4 J) ]8 x+ \% d  W7 F通过凝胶吸光度绘制标准曲线的方法定量测量

免疫与细胞

我们说待检样品，这个是不是太过宽泛了。对细胞培养来说，何时取样、取样样本类型、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。

细胞海洋

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