CIK细胞鲎试验（内毒素）检测

fsj1987

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fsj1987

我先来踩点
8 r: F5 O: l8 B: t! W4 _6 |1、实验室物品准的准备# O8 w. g8 w: T0 }
1.1        涡旋混匀器。
1 }8 B/ e; r' v$ [/ W5 N1.2        恒温水浴锅。; U# {( M+ C) R: E
1.3        鲎试剂（TAL）。
# u% N. k3 ^, ?" X* E* {7 y% r1.4        细菌内毒素工作品（CSE）。
; ]" @9 E- D2 W- m' a/ W2 \0 n9 I; S1.5        细菌内毒素检查用水（BET），内毒素含量<0.015EU/ml。' l8 l3 \6 L) a5 e: `2 J" D5 x# t
1.6        无热原试管。; \" E6 Q+ c- j. H: L. \4 ?2 F" P
1.7        无热原吸头（200ul，1000ul）。  W! V% k" m& l- U- Z% x8 x
2、内毒素标准工作品溶液的配置) W, q4 n" P; W  ~5 l
2.1内毒素标准品溶液的配置. s( M5 _- R7 ^( i5 G  Y
取细菌内毒素标准品1支，用酒精棉球消毒瓶颈，开启加检查用水1.0ml并混合15min备用。
) j) R# [# q" t: J& n内毒素标准品为10EU/支，鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml时，内毒素阳性对照稀释至2λ，即0.25EU/ml。（注：横线上方表示取浓内毒素溶液的量，横线下方表示加检查用水的量。）3 ]+ ]+ W% I; \9 P7 J
10EU/ml    1.0EU/ml     0.50EU/ml     0.25EU/ml
6 t& h* W5 v( ?* u2.2 供试品溶液的制备 4 m" w1 _9 D  A5 @
有效稀释倍数（MVD），按下公式计算：
' @3 {( N8 ^6 h7 [" \- w2 i4 XMVD=cl/λ
4 T: w. W9 C) a, r" Z* P1 T; Y式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。
! @3 X& L; C5 f如，细胞悬液其内毒素限值为2.0EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
, |3 ?2 w) j2 d- `8 i+ t$ R4 DMVD=cL/λ=1×2.0/0.125=16（倍）
# o+ V8 B, K( @取供试品0.125ml加检查用水1.875ml，混合均匀做内毒素检查用。
; v; [$ f8 E8 h( e( I. W+ g# [/ Y9 k2.3 供试品阳性对照液的制备
! B! D9 n, \6 ^+ t7 e分别取供试品的8倍稀释液0.5ml和0.50EU/ml的内毒素溶液0.5ml，混合均匀供检查用。( y3 G( @5 ?2 ?1 b
2.4 鲎试剂的准备
. q) v" Q) S7 D& P1 o根据供试品的数量，取鲎试剂0.1ml/支若干，按标示量加入检查用水复溶备用。1 V! |: X. C. E7 e
试验加样见下表1。: \8 Y: b/ o4 K2 E& B
表1供试品内毒素检查加样方法
4 a2 G  ]- h1 R' B3 p2 W* U( H. n6 m

/ t$ l3 @0 E6 R测试组（A）        阴性对照        供阳组（B）        阳性对照
7 U5 r' }: T1 m& Y, {        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号,2号5 g: K! m" ?# N6 v2 J3 o
鲎试剂溶液        0.1        0.1        0.1        0.1) ^" A7 K# @5 q: v
标本液        0.1                       
" Y7 T" p/ X1 t% x6 {+ j检查用水                0.1               
# r7 U' m8 L! R$ g8 L5 u供阳性液                        0.1       
' I+ D! H; O" ]7 b9 \$ d阳性对照液                                0.1- Q! n( ]) l8 s8 Y* Y
2.5 检测; k" \5 Q) B; Y4 D9 S2 Z
加样完毕，将试管中溶液轻轻混匀后，转移至试管内，用封口膜密封管口，垂直放入37℃恒温水浴锅中，保温（60±2）min观察结果。
5 P+ }8 ?. `' e( l/ z& c判读，时间截止将试管从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（结果判读，当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方有效）。' N" [0 ^- e5 Q7 g0 j1 w2 O

fsj1987

今天做的内毒素阳性滑落，然后第二次做就没事，不知什么原因？你们都遇到过吗？

teahouse0802

我们在实际的细胞培养过程中也会出现假阳性的情况，一般出现假阳性之后都会做平行复检。我们的内毒素检测鲎试剂是不加检测用水的，直接向鲎试剂管中加入200微升待检样品，这可能和选用的鲎试剂品牌不同有关系。
8 O" C% \+ Y/ e2 H4根管两根原来浓度，两根稀释8倍的，如果复检结果为4根管都为阴性，则判定之前的结果是假阳性。
( T: Z/ U) t- o$ |/ g" C如果复检结果未稀释的出现阳性，稀释8倍的表现阴性，而我们的内毒素限值是1.0，而鲎试剂的灵敏度为0.125，所以也判定为阴性。" t& o* {# m" T1 n
如果4根复检管都是阳性则，则表示这份细胞不合格。

teahouse0802

回复 teahouse0802 的帖子3 W" y1 _9 O/ G* t! q

+ ^$ n( W! @: @3 G, I9 B补充一下，同种浓度出现相同的检测结果才算做有效。

colins

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5 y" C2 q# K+ \0 Y) F( ]+ J
. P4 A/ ~1 N: N如果只是阳性管滑落的话，应该是你操作的时候动作幅度太大了，如果是干扰组滑落的话就应该检查你的干扰试验是不是做的合格。我偶尔碰到一些该凝胶的未凝的情况，结果复检都没事了，如果经常碰到的话就应该加强一下操作了。
) C( O5 n% U5 u+ q我觉得细胞类产品很难出现内毒素不合格，所以应该加强操作的熟练程度，我们把内毒素限值定在了0.5，很久都没见到阳性了

yingfeixiang

回复 fsj1987 的帖子& Z( @. p" n) j/ O  v' w* T  h
) f. c, L! ?' v6 o
是凝固状态后滑落的话，就是拿起看的时候剧烈碰撞了，我就又一次

baby00000003

有些个可以不通过凝胶滑落测量内毒素限度的机器
' H% @+ b! }- ^! x; W7 ?通过凝胶吸光度绘制标准曲线的方法定量测量

免疫与细胞

我们说待检样品，这个是不是太过宽泛了。对细胞培养来说，何时取样、取样样本类型、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。

细胞海洋

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