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总RNA提取（TRIZOL法）! |* x& ?9 z: v8 N; [+ p, L
1.主要试剂及配方0 q% b6 x9 m1 n# b
TRIzol® Reagent SKU# 15596-018
) z# a9 M# F( A; H, |' Z9 R7 g实验所需但试剂未提供的物品： 2 N0 H6 z1 ?/ A/ w9 s- `
* 氯仿 （专用）: a" t8 k9 w3 ?$ l7 P7 \% n
* 异丙醇 （专用）
; O& r: I- L7 @1 ~7 \* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）$ |' @9 F5 `. y- h* t
* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟） 9 { B1 K4 M. f! `5 E/ G1 w
% _) |. i8 m p' [+ \. I, k" {2.主要仪器3 ~9 \5 b% i' ~' G7 }
1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器$ U( K# X P7 e- R9 t( n) V5 d
2 x0 T1 o; M& ]9 i% X5 p( Z; u3.实验步骤: b: X, @( S5 Q$ L! A, l7 S
㈠总RNA的提取
; W3 N- C, Z% e1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）
* }& x8 Y5 \2 Q# K5 g" q$ [; @a. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 0 h Y4 T- a( a3 h/ B# T0 n
注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。3 M! k1 }. ~3 y6 w. j$ c1 f% K
2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；
. Z9 x0 T2 F9 R' N/ p5 Y( T5 l- {3. 12，000×g，4℃离心15 min；5 E9 }9 Y1 ~) v2 L
4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
+ }! L! u+ h8 u5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；: S" U: v- |5 V* ^5 u! B
6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀；
5 x% A0 U* Q. Y" f7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；
, x) B% p# H/ N' V) G( ?+ ~3 E可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。
/ Y3 U7 @3 I4 U, w' f9 [5 v8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
* p. l2 w" v# u2 v! _4 N9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度" b* N. c7 q+ f; U |8 q
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发表于 2015-8-18 09:53
