全面剖析：乳腺癌的免疫治疗新策略

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   来自布鲁塞尔自由大学的Sotiriou博士近日在CAH&O对乳腺癌免疫疗法的研究进展进行了全面解析，总结了目前免疫与乳腺癌领域已有的发现，探讨了其对临床和研究的实际意义，并描绘了乳腺癌免疫治疗的新策略。
' b4 A3 v- c& ~# Q. L. e        概述
/ S% \0 K2 I4 f$ [$ i+ L, W        近20年来我们对肿瘤的分子、基因和生物起源的认识有了极大地扩展，2000年Hanahan和Weinberg提出6种肿瘤标记用以展示人体正常细胞变为恶性细胞的过程。2011年又增加了4种与肿瘤细胞生物学多样性及侵袭宿主能力相关的标志。其中之一就是关于肿瘤细胞免疫逃逸的能力。, e. T, U- w9 G+ G
        免疫系统识别、杀伤并及时清除体内异常增生细胞、防止肿瘤发生的功能称为免疫监视。近年来研究者发现免疫系统在清除部分肿瘤细胞的同时，也对另一部分肿瘤细胞的生物学特性进行重塑，这一功能被称为免疫编辑。2 B- c$ d& I$ U
         肿瘤细胞与机体免疫系统存在3种状态：清除、对抗和逃逸。大部分明确诊断的患者处于免疫逃逸阶段。免疫逃逸的机制可能源于肿瘤细胞的抗原表达缺失或者免疫耐受环境的建立。
( l6 o8 C. y' Y. B, Z( d6 X        尽管乳腺癌并不是传统意义上的免疫原性恶性肿瘤，但是多项研究均揭示了瘤内免疫反应与肿瘤进展的密切关系，众多研究者已经清晰地认识到免疫系统在乳腺癌的进展中具有调控作用。# M5 ?5 @' E4 q/ A5 q& k3 n- b
        乳腺癌的治疗在过去10年取得了重要进展，尤其是针对人表皮生长因子受体2（HER2）阳性患者的靶向治疗的发展。但是仅有一小部分患者能够获益，并且可能出现耐受。临床需要更多的治疗方式，免疫治疗在黑色素瘤等其它恶性肿瘤治疗中显示了非常好的效果，因此研发更有效的针对乳腺癌的免疫制剂仍是非常必要的。
; B0 r% b" Y# E/ g0 P: |+ ?4 L+ w        肿瘤浸润淋巴细胞
- Q1 S' t' H  K$ M  D        肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）与原发性乳腺癌预后的关系已被关注多年。目前研究热点在于高水平的TILs能否预示新辅助化疗后的病理完全应答（pCR）。% J' b% H! N; [4 x
        德国一项纳入1058例患者的研究证实瘤内TILs的含量是pCR 的独立预测因子，淋巴细胞优势性乳腺癌（LPBC）的pCR 率超过非淋巴细胞优势性乳腺癌3倍，而无淋巴细胞浸润的乳腺癌患者仅有2%有pCR。1 {9 Y- q0 n* _7 v/ F% T  _. f8 g
        此后几项大规模队列研究共计超过3000样本的分析证实了TILs 的独立预测价值。这些研究很多都区分了瘤内淋巴细胞和基质内淋巴细胞，尽管两者密切相关，但预测强度略有差异。基质内淋巴细胞数量较瘤内淋巴细胞多故而更易获取。' N( N3 v* Z6 G5 b
        TILs与预后不良的临床-病理特征有关，包括雌激素受体（ER）阴性、肿瘤分期高、Ki-67水平高、肿瘤体积大及有淋巴结转移。高水平的TILs能够预示良好的预后，改善长期无病生存期，无病生存期（DFS）和总生存期（OS）。
4 s* a& M9 V# R# t        LPBC 在不同的研究中从4%到28%比例不一，但都显示了良好的预后。定义LPBC的淋巴细胞浸润阈值在不同的研究中从50%到60%不等。这可能是造成不同研究中LPBC比例不同的一方面原因，另一方面可能与不同研究纳入患者的标准不同有关。( f9 {; _+ _5 l: F
        比如新辅助治疗临床试验中的LPBC比例往往高于辅助治疗临床试验，可能是由于新辅助治疗临床试验会纳入较大的肿瘤。
' j* d, Z; l# `6 Z2 r% h6 j6 n        此外可能是由于纳入乳腺癌亚型的比例不同，ER阴性患者往往有较高的TILs，有些试验纳入所有类型的乳腺癌而有些试验仅纳入HER2 阳性等特定类型的患者。1 F8 W- K% p2 C1 G: z5 y4 g9 C
        还有一些因素也可以影响TILs的水平，比如治疗后处于免疫抑制状态的患者TILs水平较低，妊娠也有报道会影响TILs的数量。& c/ I5 @' T; S% v. p: X! y
        TILs预后判断的准确性与乳腺癌亚型有关。研究显示高水平的TILs预示三阴性乳腺癌和HER2阳性乳腺癌的预后较好，但在其它类型乳腺癌中未显示这种相关性。' Z; Z" I# s) M
        TILs也被证实与靶向治疗和化疗敏感性相关，但这种关系仅存在于HER2阳性患者。但TILs与赫赛汀获益的关系仍有争议。$ q! E1 y# u  z1 o  X
        FinHER 试验显示TILs与232例预后良好的HER2阳性乳腺癌患者的关于主要源于这些患者接受的赫赛汀治疗，GeparQuattro 试验也在156例HER2阳性乳腺癌患者中证实了TILs与赫赛汀获益的相关性。/ p" c3 m  ]/ {9 T
        但北部中心肿瘤治疗协作组（NCCTG）的N9831试验并未发现TILs与赫赛汀获益的关系，因此两者的关系仍有待更大规模的前瞻性研究。
) j- r9 v& U+ E! O. E! L" Y        TILs的预后价值促使大家尝试各种方法实现评估TILs的标准化。近来已有团队发表了相关的论文，建议评估基质内TILs而不是瘤内TILs，并且TILs应该作为连续变量包含除多形核白细胞的所有单核细胞。这些意见将有助于TILs在研究和临床实践中的规范化应用。+ T1 c" w* }2 d1 `
        基因表达谱：免疫标记9 `$ F% F4 u& [$ L& n
        不同的基因表达模式预示着不同的临床预后。临床常对乳腺癌进行分子分型，但各亚型的预后差异悬殊。1 C, {3 i# c0 O" a! x
        肿瘤的关键生物学过程包括7个方面：增殖、免疫应答、肿瘤侵袭、规避细胞凋亡、持续的血管再生、自足的生长信号和ER及HER2的信号。
0 S& ?/ X7 U' @3 f, b0 q  J        研究者发现这些关键过程相关的基因模块对预后的影响在不同的乳腺癌亚型中有差异。增殖和病理分期相关的基因模块与ER阳性乳腺癌患者的生存最相关，免疫应答和肿瘤侵袭相关的基因模块与HER2阳性乳腺癌患者的预后最相关，免疫应答相关的基因模块与TNBC的生存相关。2 L* z0 z* @# B! v
        多项研究证实免疫基因表达标记在乳腺癌患者中具有良好的预后判断价值，此外免疫基因富集与赫赛汀获益也有相关性。2 F$ p9 t2 z% Y' f
        将免疫基因表达标记纳入乳腺癌分型标准，有利于优化目前已有的分子分型，使得各亚型分类更精准，更助于预后和治疗敏感性的判断。3 ~0 j& r8 n% l
        免疫微环境：促癌与抑癌的对抗
( o- q- Z; J# `3 Y        免疫系统在肿瘤微环境可以发挥抗癌作用。尽管免疫系统最初是通过免疫监视预防肿瘤发生，但也有一些免疫细胞通过调节促炎通路进而抑制获得性免疫并诱发免疫耐受状态。不同免疫细胞最终产生的影响是由细胞分布和整体的免疫环境决定的。6 ^; u, F9 ?$ \+ Z" @% I
        乳腺癌中免疫浸润以T淋巴细胞为主（约75%），其次是B淋巴细胞（<20%）、单核细胞（<10%）和自然杀伤细胞（<5%）。CD3+T淋巴细胞分为CD8+、CD4+T辅助细胞（Th）和 CD4+ 调节性 T 细胞（Treg）。CD4+淋巴细胞由所有的Th细胞组成，其中部分具有激活效应，部分具有抑制效应。% l& U* {9 Z! t5 L8 n/ C& x
        不同T细胞亚型的平衡决定了抗肿瘤活性是否有效。乳腺癌不同亚型甚至同一亚型不同患者的T细胞亚型分布都有差异。Th1细胞毒性应答较强的患者预后较好。CD8+淋巴细胞是肿瘤特异的细胞获得性免疫的关键成分，其肿瘤浸润预示着较好的预后和pCR，尤其是在ER阴性的乳腺癌患者中。
3 ]- }  {8 e' Y: Y) Y. G. m        Treg则通过提升免疫耐受状态发挥对抗作用。循环Tregs在乳腺癌中升高，CD4+和CD25+Tregs在乳腺癌组织中升高，尤其是高级别和ER 阴性乳腺癌。
' i" [1 n% {' \6 ?0 X0 h$ }( K        B淋巴细胞和获得性体液免疫的作用研究较少。目前的数据显示B淋巴细胞升高预示更好的预后，但是其中的肿瘤诱发的调节性B细胞通过刺激T细胞转变为Tregs进而促进乳腺癌的转移。
7 Y6 o; q$ S% x/ B+ w; {5 \        巨噬细胞可以促进肿瘤侵袭、迁移和血管再生，与肿瘤的进展和转移有直接关系。巨噬细胞富集的乳腺癌换往往处于较高的分期、具有较高的增殖性并且预后较差。髓系衍生的抑制细胞同样被视为具有多种免疫抑制功能并且预示预后不良。
: {0 X/ _7 t0 B+ }2 ^- k        尽管肿瘤免疫微环境具有多样性，但没有证据显示这些不同的免疫细胞比TILs水平具有更高的预后判断价值。6 g7 O( i+ M0 Y. Y' Z# l/ W
        乳腺癌治疗与免疫系统& d) u- J- o' D# x
        免疫微环境随着肿瘤发展和治疗干预而处于动态变化中。尽管化疗的主要作用机理是通过干扰DNA复制、造成DNA损伤进而诱导细胞凋亡，但研究显示化疗的部分抗癌效应是通过调节免疫系统发挥作用的，比如TIL比例的增加、CD11c+树突状细胞的富集、CD8+活性的增强等。
' O! v; ?9 ~1 s) e5 k' ^        单克隆抗体赫赛汀杀伤HER2阳性的肿瘤细胞也不是直接作用，而是通过免疫机制干扰HER2信号，此外在赫赛汀治疗过程中外周血及肿瘤组织的免疫细胞都发生了改善，外周血的循环Tregs降低，肿瘤组织的CD8+、CD4+和自然杀伤细胞的活性增强，免疫应答较好的患者往往具有更好的预后。
& Q4 _: E" o8 n5 M) Z6 X& h3 |: p" {        FinHER试验显示免疫系统的抑制性调节因子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和程序性死亡因子1（PD-1）的升高与赫赛汀在HER2阳性乳腺癌患者中的获益相关。这提示赫赛汀可能具有免疫调节的作用。目前关于能否将赫赛汀作为免疫调节剂辅助治疗HER2阴性乳腺癌的临床试验正在进行。
) \/ `# v) f3 f. G1 C        免疫系统与治疗干预是相互作用的，因此治疗药物可以作为免疫系统调节剂发挥作用。揭示化疗、靶向治疗与免疫系统相互关系的生物机制还有待更多的研究。6 b9 H$ A% D, a) [; o& [$ q
        治疗策略：逆转免疫耐受
/ L* ^, E3 a; K+ Y9 ^& l        免疫系统影响着乳腺癌的病情进展及肿瘤对治疗的应答，因此是有前景的治疗靶标。利用抗原特异性单克隆抗体进行的被动免疫治疗已经成为HER2阳性乳腺癌治疗的一部分。主动免疫疗法则是通过疫苗刺激机体的免疫应答，是抗癌治疗的另一种途径。
3 E/ f! ^; ?4 u6 G8 [; W        乳腺癌研究领域最常见的疫苗是抗原肽疫苗和蛋白疫苗，都是来自胞内或胞外HER2区域。抗原肽疫苗和蛋白疫苗利用肿瘤抗原的抗原表位刺激机体产生免疫应答。疫苗还有其它类型，包括DNA疫苗，通过抗原递呈细胞将DNA呈递给免疫原性蛋白；肿瘤全细胞疫苗，来源于自体移植细胞或者恶性细胞系培养；树突状细胞体外融合，呈递肿瘤抗原。
5 O+ c7 H2 h3 P8 A  ^, t- @0 `        乳腺癌疫苗的试验已经开展了近20年，大部分评估疫苗治疗的试验在I期临床试验阶段显示了良好的安全性和诱导免疫应答的有效性，但很少有疫苗能在进一步试验中显示临床疗效。
8 t$ T5 L* P. L2 K        目前发表的仅有1项疫苗的3期随机临床试验，是针对肿瘤相关抗原 sTn设计，研究显示接受疫苗的患者体内抗肿瘤抗原的免疫反应活跃，但在进展时间、总生存期方面并未表现出显著的改善。; a; I( \; M# Z4 q
        但在两项2期临床试验综合分析中，抗癌疫苗作为辅助治疗显著降低了复发率。抗癌疫苗作为辅助手段预防癌症复发可能更有效。* S" ]: Q6 |# y8 |- W
        抗癌疫苗的发展面临很多阻碍：疫苗合成过程复杂，大规模生产很困难；由于患者HLA类型或者肿瘤表达特异抗原限制，抗原肽疫苗仅适用于小部分特定群体；以及如何获得肿瘤抗原的长期免疫能力也是目前面临的巨大挑战。
0 ^0 r, t* r; D: T7 o        大多数临床试验中，仅有少部分患者在接受疫苗治疗后的6到12月还能保持对肿瘤抗原特异性的免疫应答。
' \0 v. Y# z  Q: R        还有一种免疫治疗策略师通过阻断T淋巴细胞抗原抑制免疫系统从而逆转免疫耐受状态。目前研究较多的是CTLA-4和PD-1。" e8 Q* Q& U2 N/ _  q) v5 u4 U+ y
        CTLA-4是一种蛋白受体，表达于激活的T细胞表面，能够下调T细胞活性。PD-1是表达于激活T细胞、前B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和单核细胞表面的抗原，其配体包括程序死亡配体1和2（PD-L1和PD-L2），在维持T细胞耐受中发挥重要作用。
7 _! \6 s2 r/ s4 c        PD-1和PD-L1在乳腺癌中有异常表达，且表达与TILs相关，提示免疫反应中存在负反馈的激活。目前抗CTLA-4和PD-1抗体的临床试验都在进行中，显示出良好的前景。
1 M& e* O7 c" C. B; x7 b3 G% r        免疫治疗的挑战
& B; @( @" H) A        乳腺癌的免疫治疗存在诸多挑战：首先免疫编辑的基本原理是T细胞识别、清除肿瘤抗原的同时，挑选出不表达强排斥性抗原的克隆。有证据显示免疫治疗能够诱导免疫编辑和抗原表达的缺失。因此避免耐受需要同时刺激多种抗原，或者将免疫治疗与化疗和靶向治疗结合起来。* ?! E1 d$ l- @9 ?1 A3 \8 p8 H
        其次局部免疫抑制环境不利于免疫治疗发挥作用。抗PD-1或抗CTLA-4单克隆抗体能够阻断免疫抑制信号逆转免疫耐受状态，但目前研究均处于起步阶段。/ v) o, C; `& _- O+ m
        再次不同类型的患者可能免疫治疗获益不同。免疫应答判断预后价值最强的TNBC和HER2阳性乳腺癌患者可能效果最显著。目前尚无有效的生物标志物用于预测免疫检查点阻断抑制剂的效果。1 X  g% o5 s4 U- k1 ]
        结语' H! Q  ]2 g( j5 _
        免疫应答是机体抵抗肿瘤进展的首要防线，乳腺癌肿瘤进展与免疫系统的密切关系受到了越来越多地关注。肿瘤微环境中存在多种免疫细胞用以监控和抑制恶性进展。化疗和靶向治疗已被证实能够调节免疫微环境。了解机体的免疫应答状态能够有效判断患者的预后并指导不同类型患者选择合适的治疗策略。
& c& |2 a! _: |        目前肿瘤浸润淋巴细胞已经成为早期乳腺癌预后判断的生物标志物，免疫基因特征表达也被证实可预测三阴性和HER2阳性的乳腺癌的预后。这些发现都增加了研究者研发针对乳腺癌的免疫治疗药物的热情，多项关于抗肿瘤疫苗和免疫抑制剂的临床试验正在进行。
2 P4 B: o9 W& S) \5 H9 ]/ y" O# a        乳腺癌免疫治疗的规范化仍面临诸多挑战，疫苗能否诱导长期抗肿瘤作用和获得持续的临床获益还未可知，新的单克隆抗体治疗研究刚刚起步，免疫治疗与乳腺癌的关系尚有待时间给我们答案。
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文献名称：Immunology and Breast Cancer: Toward a New Way of Understanding Breast Cancer and Developing Novel Therapeutic Strategies